Biology - 98 مجلة إبن الهيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية 2012 السنة 25 المجلد 3 العدد Ibn Al-Haitham Journal for Pure and Applied Science No. 3 Vol. 25 Year 2012 لحشرة ذبابة فاكهة mtDNAدراسة التنوع الوراثي في الدنا المايتوكوندري Ceratitis capitata (Wiedemann, 1824)البحر المتوسط )Diptera:Tephritidae بأستخدام طريقة (PCR-RFLP في ثالث من (1)محافظات المنطقة الوسطى من العراق. محمد مهدي جواد ، حسن سعيد األسدي ، أحسان عرفان حسين ابن الهيثم ، جامعة بغداد –قسم علوم الحياة، كلية التربية 2012ايلول 12قبل البحث في: 2012حزيران 5استلم البحث في: الخالصة لحشرة mtDNAمن الدنا المايتوكوندري NADH4 (ND4)دراسة للتنوع الوراثي في جزء من الجين يتجرأ بأستخدام طريقة زوج قاعدي 400 يبلغ طوله Ceratitis capitata (Wiedemann, 1824)ذبابة فاكهة البحر المتوسط PCR-RFLP ،ستخدام االنزيم القاطع وبأ EcoRV في عينات جمعت من ثالث محافظات تقع في وسط العراق هي والكوت، وقد بينت النتائج وجود تنوع وراثي في هذه المنطقة من الجين بين عينة محافظة الكوت والعينتين ،وبغداد ،كربالء . EcoRVاالنزيم القاطع ساطةاألخرتين طبقا لنتائج الهضم بو mtDNA ، Ceratitis capitata،EcoRV، ND4 :الكلمات المفتاحية المقدمة أو Ceratitis capitata (Wiedemann, 1824) Mediterranean fruit flyتعد ذبابة فاكهة البحر المتوسط Medfly نوع من المحاصيل الزراعية 300تتغذى على أكثر من إذ ، [ 1 ] ; [ 2 ] ،أهم آفة زراعية على مستوى العالم] إال إنها تنتشر اآلن في معظم دول العالم وقد وجدت [ 4 ]أصولها تعود إلى جنوب الصحراء األفريقية من ان رغمبالو ] 3 . لقد كان أول تسجيل للحشرة في العراق 6 ] [وأمريكا الشمالية [ 5 ]؛ [ 2 ]في جنوب أوربا وأستراليا وأمريكا الالتينية وقد ] Al-Ali 8 [ مننفسه ثم أعيد تسجيلها في السبعينيات من القرن ] 7 [في اربعينيات القرن الماضي من الحيدري ونحن هنا ندرسها من الناحية الوراثية الجزيئية ] 9 [خالل االعوام القليلة الماضية مرة أخرى وجودها سجل الجبوري خاصة بالحشرة في (Database)وذلك إلنشاء قاعدة بيانات ةبالحشر ةوفي ثالث محافظات تحتوي على بساتين مصاب الناتجة بسبب اجتياحها أو اعادة اجتياحها ةالعراق وللمساعدة في القضاء عليها بأقل الخسائر ولتجنب االضرار االقتصادي ة وللتعريف بأضرارها وصفاتها التي تصل الى المستويات الجزيئي ةومعرفة مصدر قدومها في كل مر ةللمناطق المدروس والمعروف ببصمته الوراثية mtDNAالدنا المايتوكوندري تاسة التنوع الوراثي لها. لقد استخدم، فضال عن درةالدقيق واألدلة الجنائية Diagnosticsالفريدة في الدراسات التصنيفية ودراسة هجرة الكائنات الحية وفي البحوث التشخيصية Forensics [10] توكوندري لمعرفة التنوع الوراثي هذه االفة فلقد استخدم الدنا المايالى . وبالنسبةGenetic diversity . ] [ 12؛ [ 11 ] ؛ [ 6 ]ومعرفة مصدر قدومها في مجتمعات سكانية أخذت من مناطق متعددة المواد وطرائق العمل مناطق الجمع والفاكهة المصابة في ثالث محافظات من وسط العراق وهي كربالء نموذج جمعت من أماكن متعددة أ 200أعتمدت هذه الدراسة على أكثر من 2011إلى شهر آذار 2010ومن شهر تشرين الثاني نفسها إلى شهر آذار من السنة 2010من شهر شباط مدةوبغداد والكوت ولل .Lإما ثمار المشمش Kaki (Diospyros kakiوالكاكيMandarin (Citrus reticulate L. )ثمرة الاللنكي (الى بالنسبة Prunus arminiaca المصابة وثمار التينFicus carica L. إلى شهر تموز من السنة 2010فلقد جمعت من شهر حزيران لسنة Pears ( Pyrusإلى شهر حزيران من نفس السنة وقد جمعت ثمار الكمثرى (العرموط) ( 2011ومن شهر ايار لسنة نفسها communisوقد أصابت الذبابة في بساتين كربالء العنب 2011نفسها في شهر حزيران من السنة المصابةVitis sp. ، وهو مؤشر زراعي خطير جدا على العراق . ولقد جمعت العينات في بغداد من مناطق Phoenix dactyliferaوالتمر(األشرسي) وضعت .يرة و الحفرية في الكوت ومنطقتي الصو، ومن مناطق الحر وعون في كربالء ،الكريعات والراشدية والطارمية والمدائن سم يحوي من أحد جانبيه 20 × 20 × 40الثمار المصابة في قفص زجاجي وثبت عليه مكان وتاريخ الجمع. تكون أبعاد القفص ----------------------------------------------------------------------- البحث مستل من أطروحة دكتوراه للباحث االول. (1) Biology - 99 مجلة إبن الهيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية 2012 السنة 25 المجلد 3 العدد Ibn Al-Haitham Journal for Pure and Applied Science No. 3 Vol. 25 Year 2012 سم محاطة بقماش األوركنزا أو قماش آخردقيق الفتحات لمنع خروج الحشرة وإلدخال 15المربعين على فتحة دائرية الشكل قطرها أيام 7-3ن بتري صغير كل سكر مع قليل من الماء توضع على قطن في صح 3 : 1وتبديل المواد الغذائية والماء، تكون التغذية بخميرة ثم ،، ويحهز القفص بأنبوبة فيها فتيلة من الشاش تحتوي على الماء الذي يصعد في فتيلة الشاش وذلك لتربية الحشرة لحين نضجها التام زميج) أو التربة النهرية (ال ة% وتفرش أرضية القفص بنشارة الخشب الناعم70سحبها من القفص لحفظها إما بالتجفيف أو بالكحول م º 25 ± 1لتسهيل مكان تكوين العذارى ويراقب القفص يوميا للحصول على البالغات. يوضع القفص داخل حاضنة بدرجة حرارة ة أطول للحصول على الحشرات الكاملة أو اليرقات مدضوء وظالم لغرض إدامة المستعمرة لعة سا 12\12و 70 ± 5ورطوبة لغرض الدراسة. نا استخالص الد طة قمة الماصة الدقيقة بعد اغالقها بالحرارة وبإستخدام العدة الخاصة اص دنا الحشره الكلي بعد هرس الحشره بوسللقد إستخ عدة اإلستخالص بإتباع نشرة إذ استخدمت) ، UK DNeasy blood and tissue kit from Qiagen,باإلستخالص وهي ( .عملالمذاب في المحلول النهائي المست DNAمن Lµ200يتم الحصول في النهاية على ،إذ ) المرفقه Protocolطريقة العمل( PCR-RFLPطريقة ي لتضخيم المنطقة الممتدة داخل أتوكما ي1) ) (جدول N-4-N-9243و N4-8883استخدم زوج من البادئة المتخصصة ( زوج قاعدي تقريبا وهي المنطقة التي سيتم قطعها الحقا باألنزيم 400من الدنا المايتوكوندري، ويبلغ طولها حوالي ND4الجين EcoRV. PCRتضخيم الدنا بإستخدام جهاز تقانة لغرض تضخيم منطقة الجينات بإستخدام البادئات المذكورة آنفا PCRة لعمل جهاز عملمن المواد المست االتيةأضيفت الكميات وكما يأتي: ) NEB,NewEngland Biolabsمن شركة ( PCR mix ىمايكروليتر من الخليط الرئيس 12.5 مايكروليتر من كل بادئة (أمامي وراجع) 2 + 2 Double distilled waterمايكروليتر من الماء المضاعف تقطيره 5.5 DNAمايكروليتر من 3 ن مع المواد األخرى وبالنسبة ين المناسبيذبابة البحر المتوسط وزوج البادئيتم وضع الخليط المحتوي على الدنا المستخلص من عينات , Applied biosystemsمن صنع شركة ( شركة PCRالخاص بتقانة Thermal cyclerالمذكورة آنفا يتم وضعه في جهاز USA تي :يأامجزء الجين المستهدف وك ) ، حيث يتم تشغيل البرنامج االتي ولكال زوجي البادئة المستخدمة لتضخيم2720موديل دورة 1م °94 دقيقة 2 الدنترة -1 دورة 40م °94 ثانية 30 ارتباط البادئات -2 دورة 40م °46ثانية 30 دورة 40م ° 66دقيقة 2 دورة 1م °72دقيقة 2 استطالة البادئات -3 -م °4∞ حضن -4 من شركة ة المشع CYBRsafe صبغة عمال% من هالم االكاروز وباست2طة امن نواتج الجهاز بوس مايكروليتر10ثم تم ترحيل )Invitrogen ,USA1 )المطلوب هضمها بأنزيم القطع (شكل ة) لتشخيص القطعة الجيني . وحسب االضافات االتية: EcoRVمن أنزيم القطع PCRطة جهاز تقانة اثم يتم هضم الجزء الناتج من التضخيم بوس ن انزيم القطعمايكروليتر م 1 المحتوية على الجين المطلوب) PCR(نواتج DNAمايكروليتر 4 BSAمايكروليتر من البومين المصل البقري 0.2 RE bufferمايكروليتر من داريء أنزيم القطع 2 مايكروليتر ماء مقطر 12.8 نفسه لغرض الحضن مدة PCRباستخدام جهاز يحضن في حمام مائي أو الحاضنة أو مايكروليتر 20 فيصبح المجموع الكلي للخليط صبغة عمال% وباست2م حتى يتم الهضم التام . بعد ذلك يرحل الناتج بهالم االكاروز بتركيز 37ºساعات وبدرجة حرارة 4 CYBRsafe 2).المشعة وتصوير النتائج ( شكل. النتائج والمناقشة لغرض دراسة التنوع الوراثي 1) زوج قاعدي ( شكل 400) من الدنا المايتوكوندري وطوله ND4إستخدم جزء من الجين ( ) ويقوم بقطعه كما تم توضيح ذلك في طريقة GATATCالذي يتعرف على تسلسل معين هو ( EcoRVأنزيم القطع إذ استعملفيه زوج قاعدي وهو 100عدي والقطعة األخرى كان طولها زوج قا 300يكون القطع الواحد منتج لقطعتين يكون طول األكبر إذ ،العمل قام بعمله وقطع من منطقة واحدة منتجا قطعتين في معظم العينات إال EcoRVإن األنزيم ،إذما تم إيجاده في معظم العينات المدروسة ات المنطقة الوسطى من التي لم يقطعها مبينا وجود تنوع وراثي في عين2 ) عينة واحدة فقط من عينة محافظة الكوت (شكل Bو Aوهكذا فلقد حصلنا على رمزين هما Bوالتي لم تقطع أعطيت الرمز Aالعراق.وبذلك فأن العينة التي تقطع أعطيت الرمز Gasparichة من لمعزوج قاعدي على التوالي وذلك تبعاً للتسمية المست 400الناتجة من قطع وعدم قطع المنطقة التي طولها Biology - 100 مجلة إبن الهيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية 2012 السنة 25 المجلد 3 العدد Ibn Al-Haitham Journal for Pure and Applied Science No. 3 Vol. 25 Year 2012 تم تقطيع إذألول مرة ، ND4على الجين المستخدم في هذه الدراسة وهو -RFLP PCRالذين استخدموا طريقة [ 13 ]وجماعته ) فضال عن EcoRVتحتوي على موقع واحد للهضم بأنزيم القطع ( ND4قطعة من الدنا المايتوكوندري وهي جزء من الجين درسوا التنوع الوراثي للقطع الناتجة أو التي لم إذالدنا المايتوكوندري ، استخدامهم جينات وانزيمات قاطعة أخرى ألجزاء أخرى من تنتج أو لم يتم تقطيعها ومن هنا جاء التنوع. ND5و ND4هذه المرة هما ةالعمل مستخدمين منطقتين من الدنا المايتوكوندري للحشر[ 14 ] وجماعته Gasparichوقد عاود بين المجاميع السكانية لذبابة اً عالي اً ) على التوالي بعد أن وجدوا تنوعMnlI, XbaI, EcoRV(أنزيمات قاطعة هي ةولكن مع ثالث ستخدموها على ما يقرب من مئة عينة سكانية حول العالم االبحر المتوسط في هاتين المنطقتين من الدنا المايتوكوندري لها وقد Bواألنزيم الذي ال يقطع يعطى له الحرف Aطى له الحرف ن كل أنزيم يقطع يعإ إذوبترتيب معين PCR-RFLPوبطريقة حروف. ةوبالترتيب للحصول على صيغة من ثالث لدراسة التنوع الوراثي في ذبابة الفاكهة في المحافظات الوسطى من العراق ولتأسيس قاعدة PCR-RFLPطريقة توهكذا إستخدم أم من غيرها ولم نفسها يد ولمعرفة مصدرها وهل أن ذلك المصدر من المنطقة بيانات مستقبلية تفيد عند إجتياح الحشرة للعراق من جد (استخدام بادئات عشوائية لتضخيم RAPD) أو أي طريقة أخرى مثل PCRلوحدها (التي ال تستند الى تقانة RFLPتستخدم طريقة وتعددها وحسب الطريقة المالئمة لتحقيق الغرض ختالف األهداف الوذلك نتيجة PCR )طة جهاز تقانة امناطق مختلفة من الدنا بوس المطلوب . لقد بينت هذه الدراسة الجزيئية وجود تنوع وراثي في عينة محافظة الكوت مقارنة بعينتي محافظتي كربالء وبغداد ومع ذلك كان البد عليها في منطقة معينة وتهاجم المنطقة بالحشرة نظرا لكونها تعود في كل مرة يتم القضاء السيمامن اجراء دراسات من هذا النوع في تلك المنطقة للحد عملزمنية قصيرة دون معرفة مصدرها أو ان كان لديها مقاومة ضد مبيد معين أستمدة مرة أخرى وخالل نفسها من البحوث دلت على أن العديد إذوما هي طرائق مكافحتها في المنطقة التي جاءت منها ،من انتشارها وماالذي تم عمله للتعامل معها .[ 15 ]وجود مقاومة للمبيدات المستخدمة ضد سالالت معينة من هذه الحشرة ،انما الىتدهور الزراعة في البلد الى يؤدي اللذا توصي هذه الدراسة بفحص المواد الزراعية الداخلة للبلد وذلك ألن إهمال هذه الحالة لة اإلقتصادية لمناطق الريف وغيرها من األمور المعروفة.زيادة أعداد العاطلين عن العمل وتدهور الحا المصادر 1-Copeland, R.S. ; Wharton, R.A. ; Luke, Q. and De Meyer, M. (2002) Indigenous hosts of Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) in Kenya. Annals Entomol. Soc. Am., 95(6): 672-694. 2-White,I.M. and Elson-Harris ,M.M. (1992) Fruit flies of important significance :Their identification and bionomics,CAB international pub.,Wallingford,UK,601Pp 3-Liquido, N. J.; Shinoda, L. A. and Cunningham, R. T.(1991) Host plants of the Mediterranean fruit fly (Diptera: Tephritidae): an annotated world review , Entomological Society of America, Miscellaneous, 77. 4-De Meyer, M.; Copeland, R.S. ; Wharton, R.A. and McPheron, B.A. (2004) On the geographic origin of the medfly, Ceratitis capitata (Wiedemann). In Barnes , B. (ed.), Proceedings of the 6th International Symposium of Fruit Flies of Economic Importance. Ist eg Scientific Publications, Irene, South Africa. 45–53. 5-Malacrida, A. R.; Gomulski, L. M.; Bonizzoni M.; Bertin, S.; Gasperi, G. and Guglielmino, C. R., (2007), Globalization and fruit fly invasion and expansion: the medfly paradigm, Genetica 131:1-9. 6-Barr, N. B. (2009), Pathway Analysis of Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) Using Mitochondrial DNA., J. Econ. Entomol. 102(1): 401-411. . 225 – 229) ، ذبابة الفاكهة ، مجلة الزراعة العراقية ، المجلد الثاني ، الجزء الرابع ، 1947الحيدري ، درويش ،( -7 8-Al-Ali ,A.S. (1976) Chaetirellia cazthami on sunflower , FAO plant protection bulletin , 133-135. ) ، ذبابة ثمار فاكهة البحر المتوسط افة في بساتين الحمضيات و الفاكهة االخرى ، 2007الجبوري ، ابراهيم جدوع ،( -9 .Chandra, S. B. C.; Vlk, J-10صفحة . 43زارة الزراعة العراقية ، المشاكل الحلول المقترحة ، نشرة ارشادية / و L. and Kapatral, V. (2006) Comparative insect mitochondrial genomes: Differences despite 1318-(14):1308 5conserved genome synteny, African Journal of Biotechnology, 11-Lanzavecchia, S. B.; Cladera, J. L. ; Faccio, P. ; Marty, N. P.; Vilardi, J. C.and Zandomeni R. O. (2008) Origin and Distribution of Ceratitis capitata Mitochondrial DNA haplotypes in Argentina., Ann. Entomol. Soc. Am. 101(3): 627-638. 12-Elfekih,S.;Haymer,D.S.;Mediouni,J.;Hajlaoui,M.R.andMakni,M.(2006), Survey of mitochondrial DNA markers in populations of Ceratitis capitata (Wiedmann) from Tunisia., http://www.google.co.uk/search?hl=ar&tbo=p&tbm=bks&q=inauthor:%22Nicanor+J.+Liquido%22&source=gbs_metadata_r&cad=2 http://www.google.co.uk/search?hl=ar&tbo=p&tbm=bks&q=inauthor:%22Lei+Ann+Shinoda%22&source=gbs_metadata_r&cad=2 http://www.google.co.uk/search?hl=ar&tbo=p&tbm=bks&q=inauthor:%22Roy+T.+Cunningham%22&source=gbs_metadata_r&cad=2 http://www.google.co.uk/search?hl=ar&tbo=p&tbm=bks&q=bibliogroup:%22Miscellaneous+publications+of+the+Entomological+Society+of+America%22&source=gbs_metadata_r&cad=2 http://www.google.co.uk/search?hl=ar&tbo=p&tbm=bks&q=bibliogroup:%22Miscellaneous+publications+of+the+Entomological+Society+of+America%22&source=gbs_metadata_r&cad=2 Biology - 101 مجلة إبن الهيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية 2012 السنة 25 المجلد 3 العدد Ibn Al-Haitham Journal for Pure and Applied Science No. 3 Vol. 25 Year 2012 Proceedings of the 7th International Symposium on Fruit Flies of Economic Importance, Salvador, Brazil, Fruit Flies of Economic Importance: From Basic to Applied Knowledge, :53-57. 13-Gasparich,G.E.; Sheppard,W.S.; Han,H.Y.; McPherson,B.A. and Steck,G.J. (1995) Analysis of mitochondrial DNA and development of PCR-based diagnostic molecular markers for Mediterranean fruit fly (Ceratitis capitata) populations. Insect Mol Biol. 4(1):61- 67. 14-Gasparich, G. E.; Silva, J. G. , Han; H. Y. , McPheron, B. A. ; Steck, G. J. and Sheppard W. S. (1997) Population genetic structure of Mediterranean fruit fly (Diptera: Tephritidae) and implications for worldwide colonization patterns. Ann. Entomol. Soc. Amer. 90(6):790- 797. 15-Magana,C.;Hernandez-Crespo,P.;Ortego,F. and Castanera,P. (2007) Resistance to Malathion in field population of Ceratitis capitata.,J.Econ.Entomol.,100(6):1836-1843. ): زوج البواديء المستخدمة والجين المستهدف.1جدول ( الجين المستهدف االتجاه رمز البادئة النتروجينيهتسلسل البادئة من القواعد جزء من الجين NADH4 من الدنا المايتوكوندري 5-TAATAATCCATATCCTCCTA-3 N-4-J-8883 F (أمامي) TTAGTTTTAACATTTAGAAG-3-5 N-4-N-9243 ( (راجع R http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gasparich%20GE%22%5BAuthor%5D http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sheppard%20WS%22%5BAuthor%5D http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Han%20HY%22%5BAuthor%5D http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22McPheron%20BA%22%5BAuthor%5D http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Steck%20GJ%22%5BAuthor%5D http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/07742977## Biology - 102 مجلة إبن الهيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية 2012 السنة 25 المجلد 3 العدد Ibn Al-Haitham Journal for Pure and Applied Science No. 3 Vol. 25 Year 2012 زوج 400من الجين المدروس طولها ةقطع ) يعطيN-4-N-9243 و N-4-J-8883ن (ئي) :اختبار زوج الباد1شكل ( االرقام تشير الى Ceratitis capitataمن الدنا المايتوكوندري لذبابة فاكهة البحر المتوسط ND4قاعدي تقريبا من الجين يمثل واصم الوزن Mعينة الكوت، 3عينة بغداد، 2 عينة كربالء، ةعينات الدنا المأخوذه من المحافظات الثالث ، New England biolabs،(UKمن شركة( اً قاعدي اً زوج 100-1517من Molecular weight markerالجزيئي من هالم االكاروز. 2%المرحلة ب (من Molecular marker=الواصم الجزيئي EcoRV ،Mطة انزيم القطع ابوس ND4): تقطيع جزء من الجين 2شكل ( 1-30 ; اً قاعدي اً زوج 399= الجين المستهدف بطول 1، (NewEngland Biolabs,UK)من شركة اً قاعدي اً زوج1517-100 طة االنزيم القاطع مما يعطي الدليل الم يحدث فيها هضم بوس 23رقم ةمن هالم االكاروز) العين 2 % من محافظة الكوت( في ةعين .ةعلى وجود التنوع الوراثي في عينة المحافظ Biology - 103 مجلة إبن الهيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية 2012 السنة 25 المجلد 3 العدد Ibn Al-Haitham Journal for Pure and Applied Science No. 3 Vol. 25 Year 2012 Study of Genetic Polymorphism in the Mitochondrial DNA of the Mediterranean Fruit Fly Ceratitis Capitata (Wiedemann, 1824) (Diptera:Tephritidae)Using the Method of PCR-RFLP in Three Governorates in the Middle Region of Iraq. M.M.Jawad, H.S.Al-Asady, I.A.Hussein Department of Biology, College of Education Al-Haitham/ University of Baghdad Received in: 5 June 2012 Accepted in: 12 September 2012 Abstract Genetic polymorphism in a fragment of NADH (ND4),400bp long from the Mitochondrial DNA (mtDNA) of Mediterranean fruit fly ceratitis capitata (Wiedemann, 1824) using PCR-RFLP method with the restriction enzyme EcoRV in samples collected from three governorates in the middle of Iraq. The purposes of this study is to establish database, discover the introduction source as well as studying the genetic diversity for this economic pest in Iraq. The results show that there is a genetic polymorphism of the studied gene fragment among Kut governorate as compaired with the other studied samples according to digestion results of the restriction enzyme EcoRV. ND4 mtDNA , ، Ceratitis capitata، Keywords: EcoRV :