308 مجلة إبن الهيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية 2012 السنة 25 المجلد 2 العدد Ibn Al-Haitham Journal for Pure and Applied Science No. 2 Vol. 25 Year 2012 Isolation and Identification of Azadirachtin from fruits of Melia azedarach L. (Meliaceae) N. S. Mehdi, H. F. Al-Rubeae* and M. A. Ali Department of Biology, College of Education, Ibn Al-Haitham, University of Baghdad. * Ministry of Science and Technology. Received in : 28 September 2010 Accepted in :11January 2012 Abstract Azadirachtin is a naturally occurring substance that belongs to an organic molecule class which is called tetranortriterpenoids. It is on of the most powerful plant derived insecticides known, its structure is similar to insect hormones called ecdysoncs (Molting Hormone), which control the process of metamorphosis. Azadirachtin has been isolated from fruits of Melia azedarach L. The structure of this compound was determined by spectral studies (IR spectra and GC Mass spectra) and denitrified by then layer chromotochraphy (TLC). Key Word: Azadirachtin, fruits, Meliaceae . 309 مجلة إبن الهيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية 2012 السنة 25 المجلد 2 العدد Ibn Al-Haitham Journal for Pure and Applied Science No. 2 Vol. 25 Year 2012 عزل وتشخيص مركب االزدراختين من ثمار نبات السبحبح Melia azedarach L. (Meliaceae) نوال صادق مهدي ، حسين فاضل الربيعي *، محمد علي عبد المنعم ابن الهيثم، جامعة بغداد-كلية التربية ،قسم علوم الحياة وزارة العلوم والتكنولوجيا * الخالصة وهو من اقوى Tetranorterpenoidي يعود الى مجموعة من المركبات تسمى االزدراختين مركب عضوي طبيع المركبات العضوية ذي االصل النباتي تركيبه الكيميائي يشابه هرمونات الحشرات المسماة االكداسيون (هرمونات االنسالخ) . وقد .Melia azedarach Lالتي تسيطر على عمليات التشكل فيها ، تم عزل هذا المركب من ثمار نبات السبحبح اثبتت الدراسات الطيفية ( قياس طيف االشعة الحمراء وقياس طيف الكتلة ) عزل هذا المركب وتم تنقيته والكشف عنه بطريقة كروماتوغرافيا الصفائح الرقيقة. .Meliaceaeالسبحبح، ازدراختين، عائلة الكلمات المفتاحية: المقدمة قة من النباتات استند الى اساس كونهـا ذات ضـرر اقـل فـي النظـام البيئـي، وقـد ان البحث عن مبيدات حشرية مشت ) مركبـات نباتيـة ذي تـأثير سـمي فـي 1005) مركـب كيميـائي نبـاتي منهـا (10000تم خالل العقدين االخرين عـزل حـوالي ( مركبـــاً ذا تـــأثير مثـــبط للنمـــو ) 31) مركبـــاً ذا تـــأثير طـــارد و (279) مركبـــاً ذا تـــأثير مثـــبط للتغذيـــة و (348الحشــرات و ( ].1وخمسة مركبات تسبب العقم في الحشرات [ ان هــذه المركبــات متنوعــة ومعقــدة التركيــب الكيميــائي وقــد اختلــف العلمــاء فــي تصــنيفها فمــنهم مــن صــنفها تبعــاً لمركبــات القلويــدات للتركيــب الكيميــائي، ومــنهم مــن صــنفها تبعــاً لمصــدر تكونهــا خــالل عمليــات االيــض الحيــوي ومــن اهــم ا ].2والفينوالت والكاليكوسيدات والتربينات [ من المركبات الكيمياوية المهمة التي تعود لمجموعة التربينات ما يعرف بالستيرويدات النباتية وهي مركبات حلقية المهمـة التابعـة لهـذه ) فـي الحشـرات ومـن المركبـات Ecdysonمعقدة التركيب تشبه في تركيبها الكيمياوي هرمون االنسالخ ( والــــــــ Rutaceaeوهي مركبات خماسية الحلقة تتواجد في بعض العوائل النباتية منهـا Limonoidالمجموعة ما يعرف بالــــــ Simarobaceae والــــــــMeliaceae تتميـز هـذه المركبـات بطعمهـا المــر وبفعاليتهـا الفسـلجية العاليـة فـي االفـات الحشــرية . ]. ومن اهم المركبات التي تعـود الـى مجموعـة الــــــــــ 3شكل وسيلة دفاع مهمة ضد هجوم الحشرات واالحياء االخرى [وباتت ت Limonoid هــذا مركــب االزدراختــين الــذي امكــن عزلــه مــن انــواع مــن العائلــة الزنزلختيــةMeliaceae مثــل النــيم والســبحبح عام Heinrich Schmuttererبها هذا المركب الحظها اول مرة العالم ]، ان الخصائص القاتلة للحشرات التي يتميز4,5[ 310 مجلة إبن الهيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية 2012 السنة 25 المجلد 2 العدد Ibn Al-Haitham Journal for Pure and Applied Science No. 2 Vol. 25 Year 2012 عنـدما اجتــاح الجــراد المهــاجر الســودان ،اذ يتبــين ان اشــجار النــيم لــم تتــأثر بــذلك وقــد وجــد أن لــه فعاليــة شــديدة ضــد 1959 ].6,7ية [العديد من االفات الحشرية المخزنية والمن والجراد والحشرات الماصة للدم ذي االهمية الطب ]. وهـو مركـب ربـاعي Zanno et al., 1975] (8) مـن قبـل العـالم (C35H44O16وقـد عـرف تركيبـه الكيميـائي ( الحلقــة يعــود الــى مجموعــة التربينــات الثالثيــة وقــد وجــد ان لهــذا المركــب تــأثيراً مانعــاً للتغذيــة ووضــع البــيض ومعــوق لنمــو وتطور الحشرات. ث العلميــة والتجــارب الحقليــة حــول اســتعمال هــذا المركــب فــي الســيطرة علــى مختلــف وقــد اجريــت الكثيــر مــن البحــو االفات الزراعية والسيما الحشرات نباتية التغذية من رتبتي حرشفية االجنحة وعمدية االجنحـة، كمـا شخصـت فعاليتـه الشـديدة نـــواع اخـــرى مـــن االحيـــاء منهـــا الديـــدان تجـــاه العديـــد مـــن الحشـــرات ذي االهميـــة الطبيـــة، كمـــا عرفـــت فعاليتـــه الشـــديدة تجـــاه ا ] ومــرض المالريــا 12]، كــذلك اســتعمل هــذا المركــب فــي عــالج مــرض الســكر [9,10,11والفطريــات واالبتــدائيات وغيرهــا [ ]. تمكنــت بعــض الــدول مثــل 14] كمــا وجــد ان هــذا المركــب يمنــع نمــو الخاليــا الســرطانية [13والرومــاتزم وامــراض اخــرى [ المانيــا والهنــد مــن انتـــاج تحضــيرات تجاريــة يــدخل فــي تركيبهـــا هــذا المركــب لغــرض اســتعمالها كمبيـــدات الواليــات المتحــدة و ]. 7حشرية [ .Melia azedarach Lيهــدف هــذا البحــث الــى عــزل وتشــخيص مركــب االزدراختــين مــن ثمــار نبــات الســبحبح .Meliaceaeالمستزرع في العراق والتابع لعائلة المواد وطرائق العمل جمع ثمار النبات .1 مــن مواقــع متفرقــة مــن محافظــة بغــداد، تــم تشــخيص النبــات مــن M. azedarachجمعــت ثمــار نبــات الســبحبح المعشب الوطني العراقي في ابي غريب. نظفت الثمار من االتربة وجففت في مكان دافيء ومضلل، بعدها طحنـت بمطحنـة ة زجاجاية نظيفة ومعقمة.، وضع مسحوق الثمار في قنينmesh) 60-50كهربائية ( . عزل مركب االزدراختين2 ] في فصل مركب االزدراختين التي تتلخص باالتي:Yamasaki et al., 1986] (5اتبعت طريقة ( هكسـان -مـن مـذيب ن 3) سـم750) غم من مسحوق ثمار السبحبح فـي بيكـر نظيـف، اضـيف اليـه (300وضع ( مال الخــالط المغناطيســي وبدرجـة حــرارة الغرفــة، تــرك ليبــرد وازيــل الراشــح، اعيــد مـع التحريــك المســتمر لســاعات عديــدة بأســتع من مذيب الميثانول وازيل الراشـح، كـرر االسـتخالص بالميثـانول 3) سم750استخالص مسحوق الثمار مرة ثانية بأستخدام ( ز المبخـر الـدوار ليعطـي مسـتخلص مرة اخرى ثم ترك ليركد وازيل الراشح، جمع راشح الميثـانول وعـزل المـذيب بوسـاطة جهـا مـاء 3) سـم300ميثـانول واضـيف اليـه ( 3) سم300) غم، اذيب المستخلص االخير في (28(بشكل قطران) برتقالي اللون ( مــن مــذيب ثنــائي كلــورو الميثــان 3) ســم300هكســان و (-مــن مــذيب ن 3) ســم300مقطــر مــع التحريــك بلطــف ثــم اضــيف ( الى طبقتين عزلت الطبقة السفلى (مذيب ثنائي كلورو الميثان) ثم تبخير المـذيب بجهـاز وجمعت في قمع الفصل، اذ تميزت المبخر الدوار ليخلف مادة صلبة برتقالية اللون تمثل مادة االزدراختين الخام. . تنقية مركب االزدراختين3 311 مجلة إبن الهيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية 2012 السنة 25 المجلد 2 العدد Ibn Al-Haitham Journal for Pure and Applied Science No. 2 Vol. 25 Year 2012 هـا اسـتعمل الوعـاء ) وفيTLC)Thin Layer Chromatographyاتبعـت طريقـة كروموتوغرافيـا الصـفائح الرقيقـة ) علـى التـوالي 11:9بنسـبة ( )هكسـان:ايزوبروبانول-) سـم ذو غطـاء زجـاجي، اسـتخدم مـزيج (ن30الخاص وكان ارتفاعه ( ) 0.250) سـم مغطـاة بطبقـة سـمكها ((20x20]، اما الصفائح المستخدمة فكانت صـفائح لدائنيـة بابعـاد 5لغرض الروغان [ ) 3)ْ م مــدة (100نشـطت فـي فــرن حـراري بدرجـة ( Marckلمجهـزة مــن شـركة وا Silica Gel 60HF245ملـم مـن مـادة مـن كحـول االيثـانول ورج جيـدا لحـين الـذوبان، 3) سـم2) غم من مركب االزدراختين الذي تم فصله فـي (0.1دقائق. اذيب ( يرة وكانـت وضعت قطرات صغيرة مـن المحلـول الكحـولي السـابق بوسـاطة انابيـب شـعرية وتركـت لتجـف علـى شـكل بقـع صـغ ) سـم عنـد حـافتي الصـفيحة. وضـعت الصـفيحة داخـل الوعـاء الزجـاجي 2) سـم وتركـت مسـافة (2المسافة بين بقعـة واخـرى ( الخاص على ان يكون مستوى المحلول تحت موضع بقع محلول المركب، غطي الوعاء باحكام وترك تحت ظروف المختبر الصحيفة بقليل، اخرجت الصحيفة وتركت لتجـف وعرضـت لالشـعة فـوق وتم مراقبة وصول حافة المذيب ما قبل نهاية حافة ).Rf )Mobility Relative to Frontالبنفسجية لتحديد موقع البقع حسب الـــــ ) غــم مــن مــادة الفــانيلين 3تــم الكشــف عــن مركــب االزدراختــين باســتعمال الكاشــف الخــاص والمحضــر مــن اضــافة ( من الكحول االثيلـي ورج جيـدا لحـين الـذوبان، اذ 3) سم100المركز واضيف اليهما (من حامض الكبريتيك 3) سم1.5الى ( بالكاشف. TLCرشت صفائح الـــــــ ظهرت بقع مركب االزدراختين بلون بني محمر تحول الى االخضر. .الدراسات الطيفية لمركب االزدراختين4 اجــري تحليــل طيــف االشــعة تحــت ):IR )Infra Red Spectroscopyالتحليــل الطيفــي باالشــعة تحــت الحمــراء -أ Pye-Unicam SP3 Infra Red Spectroscopy (England)الحمـراء بأسـتخدام جهـاز مطيـاف تحـت الحمـراء نـوع ).KBrوذلك بعمل نموذج للمادة في قرص من مادة بروميد البوتاسيوم ( نــــوع GC-Msالمعــــزول بجهــــاز : قــــيس طيــــف الكتلــــة للمركــــب (االزدراختــــين)GC Massقيــــاس طيــــف الكتلــــة -ب Schimadzu Specterometer QP1000A ) بأسـتخدام قطـب االدخـال المباشـرDirect Inlet Probe ومـدى طيـف ( ).M/z= 1-1000كتلي ( النتائج والمناقشة فصل وتنقية مركب االزدراختين -1 لكمية قليلة بالمقارنة مع ) غم من مسحوق ثمار السبحبح وتعد هذه ا300) غم لكل (1.2تم الحصول على ( ] عند فصل مركب االزدراختين من لب البذور المعزولة من ثمار النيم Yamasaki et al., 1986] (5ماذكره ( )Azederachta indica) التابع لنفس عائلة السبحبح وهي العائلة الزنزلختية (Meliaceae وهذا يدل على ان ثمار ،( ركب من ثمار نبات السبحبح من الصعب جدا فصلها من الثمار لذلك جرى طحن الثمار النيم قد تتضمن كمية اكبر من الم كاملة وليس البذور كما في المصدر. 312 مجلة إبن الهيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية 2012 السنة 25 المجلد 2 العدد Ibn Al-Haitham Journal for Pure and Applied Science No. 2 Vol. 25 Year 2012 ) 11:9ايزوبوبانول) بنسبة (-هكسان -بأستخادم المذيب (ن TLCوعند اجراء عملية تنقية المركب بطريقة الــــــ ] عند رشها بالكاشف 5بني محمر تحول لالخضر وهذا يتطابق مع [على التوالي، ظهرت بقع مذنبة للمركب تلونت بلون Morgan and) وهذا يتطابق مع (0.56للبقعة وجد انها ( Rfالخاص وهذا يؤيد فصل المركبات المذكور، وعند قياس الـــــ Thornton, 1973] (15.[ الدراسات الطيفية لمركب االزدراختين -2 ) 1النموذج المركب المفصول من ثمار السبحبح القمم الواضحة في الشكل (اظهر طيف االشعة تحت الحمراء . اما O-Hلمجاميع Stretching Vibrationتعزى الى اهتزاز امتطاطي cm-1) 3460حيث اذ القمة العريضة عند ( ) حزما 1الشكل (ويالحظ في C=Oفتنتج عن االهتزاز االمتطاطي لمجاميع الكاربوتيل cm-1) 1740الحزمة القوية عند ( وان هذه القمم تشابه C=Cالتي تمثل االهتزازات المرنة لمجاميع cm-1) 1620و( cm-1) 1650ضعيفة ايضا عند ( ].16كثيرا طيف االشعة تحت الحمراء لمركب االزدراختين القياسي [ Fragmentation( ) قياسات طيف الكتلة النموذج مادة االزراختين المعزول، ان نمط التكسر2يظهر الشكل ( Pattern 22,23ثنائي الهايدروازدراختين 23,22) يشابه كثيراً نمط التكسر لطيف الكتلة لنموذج االزدراختين Dihydroazadirachtin ذي الصيغة الجزيئيةC35H46O16 ]16) والوزن الجزيئي له [722.71 (g.mol-1 ]17.[ المصادر 1. Grange, M. S.; Ahmed, W. C. and Mitchell, T. W. Plant species reportedly possessing pest control properties. Ann. EWC/VH Database. Resource System Institute, Est. West. Center, Honolulu, Hawaii, USA. والنشــر، جامعــة بغــداد: ) العقــاقير وكيميــاء النباتــات الطبيــة. بيــت الحكمــة للطباعــة 1989. الشــماع، علــي عبــد الحســين (2 صفحة. 397 3. Harborne, J. B. (1973). Phytochemical methods, Aguide modern techniques of plant analysis. Halsted Press. John Wiley and Sons, New York: 278 pp. 4. Al-Sharook, Z. M.; Balan, K.; Jiang, Y. and Rembold (1991). Insect growth inhibitors from two tropical Meliaceae effect of crude seed extracts on mosquito larvae. J. Appl. Entomol., 111: 425-430. 5. Yamasaki, R. B.; Kloke, J. A.; Lee, S. M. Stone, G. A. and Darlington, M. V. (1986). Isolation and purification of azadirachtin from neem (Azadirachta indica) seeds using chromatography and high-performance liquid chromatography.J. Chromatog., 356: 220-226. 6. Veich, G. E.; Boyer, A. and Ley, S. V. (2008). The azadirachtin story. Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 47: 9402-9429. 7. Parmar, B. S. and Singh, R. P. (ed.) (1993). Neem in Agriculture, Indian agricultural Research Institute. New Delhi, 110012: 85 pp. 313 مجلة إبن الهيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية 2012 السنة 25 المجلد 2 العدد Ibn Al-Haitham Journal for Pure and Applied Science No. 2 Vol. 25 Year 2012 8. Zanno, P. R.; Mura, I. and Nakanishi, K. (1975). Structure of the insect phagorepellent, azadirachtin, application of PRFT/ CWD carbon-13. Nuclear magnetic resonance. J. Am. Chem. Soc., 97: 1975-1977. 9. Akhter, Y.; Yeoung, Y. R. and Isman, M. B. (2008). Comparative bioactivity of selected extracts from Meliaceae and some commercial botanical insecticides against two noctuiel caterpillars, Trichoplusia ni and Pseudaletia unipuncta, Phytochem. Rev., 7: 77-88. 10. Mulla, M. S. and Su, T. (1999). Activity and biological effects of neem product against arthropods of medical and veterinary importance. J. Am. Mosq. Control Assoc., 15: 133-152. 11. Rembold, H. (1989). Azadirachtins: their structure and mode of action. In: Insectreides of plant origin, ACS Symp-Ser. 387 (eds-Arnason, J.T.; Philogene, B. J. R. and Morand , P.): 150-163 pp. American Chemical Society, Washington, DC. 12. Khosla, P.; Bhanwra, S.; Singh, J.; Seth, S. and Srivastava, R. K. (2001). Astudy of hypoglycaemic effects of Azadirachta indica (Neem) in nonmaland alloxan diabetic rabbits. Indian J. Physiol. & Pharm., 44: 69-74. 13. Toh, M.; Babajan, B.; Ragavendra, P. B.; Sureshkumar, C. and Manna, S. K. (2011). Azadirachtin interacts with retinoic acid receptors and inhibits retinoic acid mediated biological responses. J. Biol. Chem., 286: 4690-4702. 14. Priyadvaini, R. V.; Murugan, R. S.; Sripriya, P., Karunagaran, D. and Nagini, S. (2010). The neem limonoids azadirachtin and nimbloide induce cell cycle arrest and minochondria- mediated apoptosis in human cervical cancer (Hela) cell. Free Radic. Res., 44:624-634. 15. Morgan, E. D. and Thornton, M. D. (1073). Azadirachtin in the fruit of Melia azedarach L., Phytochem., 12: 391-392. 16. Butterworth, J. H. and Morgan, E. D. (1971). Investigation of the locust feeding inhibition of the seed of the neem tree Azadirachta indica insect. Physiol., 17: 969-977. 17. NIST (1998). National institute of standards technology, Mass Spectrometry Database center IA, USA. 314 مجلة إبن الهيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية 2012 السنة 25 المجلد 2 العدد Ibn Al-Haitham Journal for Pure and Applied Science No. 2 Vol. 25 Year 2012 .M. azedarach L): طيف االشعة تحت الحمراء لمركب االزدراختين المعزول من ثمار السبحبح 1شكل( 315 مجلة إبن الهيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية 2012 السنة 25 المجلد 2 العدد Ibn Al-Haitham Journal for Pure and Applied Science No. 2 Vol. 25 Year 2012 .M. azedarach L ول من ثمار السبحبح: طيف الكتلة لمركب االزدراختين المعز)2شكل (