IBN AL- HAITHAM J. FOR PURE & APPL. S CI VOL. 23 (3) 2010 Use of Partial Purified Lipase From local Chicken kidney for Improvement the Flavor o f Butter Fat A. N. Al-Hasnawi, M. A. Al-Soufi ,R. A. Aziz Departme nt of Science, College of Basic Education, Unive rsity of Al- Mustansiriya *Center for Market Research and Consumer Protection, Unive rsity of Baghdad Abstract Lip ase was extracted by Sodium acetate buffer (p H=6; 0.05M ) Containing 0.1M NaCl. Enzy me content of crude extract was concentrated by gradual addition of ammonium sulfate at 30-60% saturation. The dialyzed extract was p urified on ion-exchange chromatography through DEAE–Cellulose and gel-filtration chromatography through sep hacry l S-200 column. The sp ecific activity , enzy me y ield and fold p urification were 54.06 unit/mg, 42.6% and 10.88 resp ectively. The molecular weight of the Lip ase was 43.651 KDa as determined by gel-filtration chromatography through sep hacry l S-200 column. Partial p urified lip ase used for the imp rovement of t he flavor of butt er fat after 12 hours for storage. IHJPAS 2010) 3( 23 مجلة ابن الھیثم للعلوم الصرفة والتطبیقیة المجلد المنقى جزئیا من كبد الدجاج المحلي في تحسین خواص استعمال أنزیم الالیبیز الدھن الحر ، رغد أكرم عزیز*نوري الحصناوي، محمد عبد الرزاق الصوفيعلي الجامعة المستنصریة –كلیة التربیة األساسیة / قسم العلوم جامعة بغداد –مركز بحوث السوق وحمایة المستھلك * الخالصة دروجیني مقـ 0.05استعمل محلول خـالت الصودیوم الـدرائ بتركیز الر ذي اس ھـی د 6داره مو ــى كلورـی والحـاوي عل دجاج، 0.1الصـودیوم بتركیـز د اـل ـن كـب وم بنسـبة إشـباع ومــوالر السـتخالص األنـزیم ـم رسـب األنـزیم بملـح كبریتـات األمونـی ــراوحت بــین ــادل االیــوني % 30-60ت ــتعمال المرشــح DEAE-Celluloseتـــالھا امــراره علـى المب ــي باس ــم الترشـیح الھالم ث Sephacry l S-200 وعیة مقـدارھا لل ـة بلغـت /وحدة 54.06حصول علـى األنزیم بفعالیـة ـن وبعـدد مـرات % 42.6ملغم وحصیـل ي لألنـزیم 10.88تنقیـة وزن الجزیـئ ــغ اـل ــتعمال 43.651مـرة، وبل ـره باتبـاع تقانـة الترشـیح الھالمـي باس د تقدـی و دالتــون عـن كیـل Sephacryالمرشح الھالمـي l S-200ن خـالل متابعـة ، وجـرى اختبار األنزیم دھن الحـر ـم ي تحسـین خـواص اـل المنقى جزئیا ـف دھن مقبولـة بعـد مـرور 12التغیر الحاصل في أنموذج الدھن الحر الحاوي على أنزیم الالیبیز المنقى جزئیا، إذ أصـبحت رائحـة اـل . ساعة على الخزن المقدمة Hy(للة الالیبیز إلـى مجموعة االنزیمات المح أنـزیم نتمـيی drolases (Hy drolytic Enzy mes الذي یمتلك التسـمیة ي أیـ[1]وفقا للتصنیف المعتمد من االتحاد العالمي للكیمیاء الحیاتیة EC: 3.1.1.3النظامیة ن ض، ویؤدي دوراً مھماً ـف الخلیـة ـم ي خالل التفاعالت التي یعمل بھا على كسر رابطة معینة في جزیئات المادة المتفاعلة وإضـافة ى المـواد الناتجـة الـت جزیئـة مـاء إـل ل األواصـر Esterases، ویقع أنزیم الالیبیز ضمن مجموعة أنزیمات [2]غالبا ما تكون تفاعالت عكسیة ـى تحلـی التي تعمـل عـل ـ Carboxyاالستریـة في الدھون والزیـوت والتي یطلـق علیھـا ـب lic Esteraseل ، كمـا یعـرف الالیبیـز بأنـھ أحـد أنزیمـات التحلـ المائي السترات الكلیسیرول الذي یعمل على تحلیل األواصر االستریة للدھون، ویتطلب عمـل أنـزیم الالیبیـز وجـود الكلیسـیریدات ل األواصـر االسـتریة [3]درجة الذوبان الواطئة في الماء مادة أساس يالثالثیة ذ ، وینتج عن فعل أنزیم الالیبیز بعد أن یقوم بتحلـی د فقـدان المـاء لیكـون الكلیسـیریدات في الظروف الطبیعیة س التفاعـل عـن وم بعـك كال من الكلیسیرول واألحماض الدھنیة، إال انھ یـق ع [4]الثالثیة من الكلیسیرول واألحماض الدھنیة الحرة بعملیة االسترة ، ویقوم أنزیم الالیبیـز بعملـھ ھـذا عـن طریـق تعرفـھ للمواـق ون بشـكل منفـرد المحددة في جزیئة الكلیسیریدات الثالثیة ـع الكرـب ـع األول والثالـث مـن مواق ومھاجمتھ لألحماض الدھنیة في الموق ع األحمـاض ذي ینتقـل إلـى موقعـھ ـم ي جزیئـة الكلیسـیرول اـل أو مجتمع معا، إال انھ ال یھاجم الحامض الدھني في الموقع الثـاني ـف دھني الدھنیة من خالل قیام جزیئة الكلیسیرول األحادیة بتنظیم نفسھا والتخ ى لص من الحامض اـل ق دفعـھ إـل ق لھـا عـن طرـی المراـف . [5]األحماض الدھنیة المنفصلة عن جزیة الكلیسیریدات الثالثیة یتواجد األنزیم بشكل واسع في الكائنات الحیـة ویـتم اسـتخراجھ وإنتاجـھ علـى المسـتوى التجـاري مـن مصـادر مختلفـة، إذ 4و 8و 25اج العالمي في حین تشكل المصادر البكتریـة والحیوانیـة والنباتیـة نسـب مقـدارھا من اإلنت% 50تمثل الفطریات نسبة المي لھـذا األنـزیم % ــة، إذ [6 ; 7]علـى التـوالي مـن اإلنتـاج الـع الت التطبیقیـة المختلف ي المجـا الت واسـعة ـف ، ولألنـزیم اسـتعما وزیـادة ظھـور نكھـة الجـبن ،مساھمتھ في تحلیل دھن الحلیـبصناعة األلبان من خالل مثل یستعمل في مجال الصناعات الغذائیة ن الرائحـة غیـر [8]واإلسراع في عملیة اإلنضاج ، دھن الحـر مـن خـالل الـتخلص ـم مقبولـة ال، كما یستعمل في تحسـین خـواص اـل ز وجعلـھ ا[9]لھذا النوع من الدھون ى صـفات الخـب م والمحافظـة عـل ــي ، كما یستعمل في صناعة الخبز لتحسـین الطـع كثـر ثباتـا ف ى عجینة الخبـز الت األخـرى یسـتعمل الالیبیـز [10]درجات حرارة الخزن عـن طریق إضافتھ مـع أنزیم االمیلیز إـل ي المجـا ، وـف ي صـناعة دة، فضـال عـن اسـتعمالھ ـف بشكل واسع في صـناعة الزیـوت الصـناعیة وإنتـاج صـابون ذي نوعیـة عالیـة وصـفات جـی ــى م ــافتھ إل ــن طریــق إض ــات ع ــة المنظف ـف التجاری ــرات التنظـی ــناعات الصــیدالنیة [11]ستحض ــال الص ــي مج ــتعمل ف ــا یس ، كم ونظراً الحتواء كبد الدجاج على نسبة عالیة من ھذا األنزیم من خالل ، [13]وإنتاج الوقود الحیوي [12]ومستحضرات التجمیل 2010) 3( 23 مجلة ابن الھیثم للعلوم الصرفة والتطبیقیة المجلد IHJPAS ي ي واسـتعمالھ ـف ن كبـد الـدجاج المحـل المقارنة مع المصادر األخرى، لذا فقد ھدف ھذا البحث إلى إنتـاج الالیبیـز وتنقیتـھ جزئیـا ـم .تحسین خواص الدھن الحر المواد وطرائق العمل :تحدید المحلول االمثل الستخالص األنزیم داسـتعملت محالیـل اسـتخالص عد نـی ى ة شـملت كـل ـم د 0.1مـاء المقطـر ومـاء المقطـر الحـاوي عـل مـوالر مـن كلورـی دارئ بتركیـز ،الصودیوم داره 0.05ومحلول خـالت الصـودیوم اـل دروجیني مـق الر ذي اس ھـی ومحلـول خـالت الصـودیوم ، 6مـو داره 0.05الدارئ بتركیز دروجیني مـق الر ذي اس ھـی ى 6مـو د 0.1والحـاوي عـل ــن كلوریـد الصـودیوم لتحدـی ول مـوالر م المحـل م االسـتخالص باسـتعمال ى قطـع صـغیرة بمسـاحة 10األمثل الستخالص األنزیم، وـت دجاج المحلـي الـذي قطـع إـل د اـل غـم مـن كـب دة 50سم لكل قطعة واضیف لھ 0.5حوالي مللتر من محلول االستخالص المبرد وجرى استخالصـھ بوسـاطة خـالط كھربـائي ـم تخلص مـن الشـوائب بو 5 ذ المركـزي المبـرد بدرجـة حـرارة دقائق، بعدھا تم اـل م اجـري النـب ن قمـاش الملمـل ـث م 4سـاطة قطـة ـم دة /دورة 5000وبسـرعة مقـدارھا ــة ـم ــل 15دقیق ق الـذي یمث ــى الراـئ تخلص مــن الراسـب والحصـول عل م اـل دقیقـة للمســتخلص وـت . المستخلص األنزیمي الخام :تقدیر الفعالیة االنزیمیة pباستعمال [14]یمیة وفقا للطریقة التي قام بوصفھا قدرت الفعالیة األنز -nitro p henyl buty rate (p NPB) مادة ى قیـاس االمتصـاص الضـوئي للمــادة الناتجـة عنـ تأسـاس، و قـدر ــاد عـل ــداره دالفعالیـة األنزیمیـة باالعتم وجي مق 410طـول ـم ول واحـد مـن مـادة نانومتر، وعـرفت وحـدة الفعالیـة األنـزیمیة بأنھـا كمیـة األنـزیم ا pلـالزمة لتحریـر ملـي ـم -nitro p henyl .م 40دقیقة بدرجة حرارة 15خالل الدقیقة الواحدة تحت ظروف التفاعل المتمثلة بحضن األنزیم لمدة :تقدیر تركیز البروتین ــن ـة م ـا للطریقــة الموصوـف ــروتین وفـق ـركیز الب ــن الم [15]قـدر ـت ـال ألبومی BSA (Bovine(صــل البقـري باستعـم Serum Albumin روتین خـالل خطـوات الفصـل الكرومـاتوكرافي باسـتعمال اقیاسی ابروتین ، في حین تم الكشف عـن تـركیز الـب المتصاص الضوئي على موجة مقدارھا .نانومتر 280ا :تحدید الطریقة المثلى لتركیز االنزیم :التركیز باستعمال ملح كبریتات االمونیوم -أ م %20-90استعملت نسب إشباع تراوحت بین ، وذلك بإیصال المستخلص األنزیمي الخام إلى نسبة اإلشـباع المطلوبـة ـث دارھا 4فصل الرواسب المتكونة بعد كل إضافة بوساطة النبذ المركزي المبرد بدرجة حرارة دقیقـة /دورة 10000م وبسـرعة مـق الر ذي 0.01ب المتكونة بعد كل إضافة بوساطة محلول خالت الصودیوم الدارئ بتركیـز دقیقة، وجرى إذابة الرواس 15مدة مـو ى فعالیـة إنزیمیـة، جمعـت الرواسـب المتكونـة وأذیبـ6اس ھیدروجیني مقداره ي ت، وبعد تحدید نسب اإلشباع التي أعطـت أعـل ـف دة ھ واجریت لھ عملیة التنافذ الغشائي حیال المـاء المقطـنفسالمحلول الدارئ ـع اسـتبدال المـاء 4سـاعة بدرجـة حـرارة 24ر ـم م م .ساعات، تالھا تجفید األنزیم 6المقطر كل :التركیز باستعمال الكحول االثیلي المبرد -بـ ك % 98تم تركیز المستخلص األنزیمي بإضافة أحجام معینة مـن الكحـول االثیلـي المبـرد ذي تركیـز ـع التحرـی درجیا م ـت د كـل إضـافة %20-80ل على نسب مئویة متدرجة من الكحول تراوحت من المستمر للحصو ـلت الرواسـب المتكونـة بـع م فص ، ـث دة /دورة 10000م وبسرعة مقدارھا 4بالنبذ المركزي المبرد بدرجة حرارة دقیقـة وأذیـب الراسـب المتكـون مـن كـل 15دقیقة ـم .یة وتركیز البروتین فیھمرحلة في اقل كمیة من دارئ الفوسفات وقدرت الفعالیة األنزیم :تنقیة االنزیم DEAE-Ceتنقیة االنزیم بأستعمال المبادل االیوني -أ llul ose: ى مع إجراء بعض التحویر، إذ [16]نقي األنزیم وفقا لما وصفھ ن الخطـوة السـابقة عـل ألنزیمي المركز ـم مرر المحلول ا ــي ــود المبـادل االیون ول سـم، x 30 1.5 أبعـادذي DEAE-Celluloseعم د غسـل المبـادل بضـعف حجمـھ بوسـاطة محـل وبـع ــز الموازنـة ــالت الصــودیوم الـدارئ بتركی ــداره 0.05خ دروجیني مق الر ذي اس ھـی ــة بســطح 6مــو ــتردت األجـزاء المرتبط ، اس ول بالمبادل بوساطة التدرج الملحي الخطـي دارئ بتركیـز محـل درو 0.05خـالت الصـودیوم اـل الر ذي اس ھـی ــو ــداره م 6جیني مق ـوم بتـــراكیز متدرجـــة مـــن ــت األجــزاء المنفصـلة بواقــع 0-1والحـاوي علـــى كلوریـــد الصودـی ــر 3.5مـوالر، وجمع ــزء /مللت ج د طـول مـوجي /مللتر 42وبسرعة جریان مقدارھا درج الملحـي الخطـي، بعـدھا قـیس االمتصـاص الضـوئي عـن ساعة بوساطة الـت وجمعت األجزاء القریبـة مـن قمـة منحنـى الفعالیـة ،مللتر/لة وقدرت الفعالیة األنزیمیة وحدةنانومتر لألجزاء المنفص 280مقداره روتین ملغـم ،مللتـر/وقیست الفعالیة األنزیمیـة لھـا وحـدة، د رسـم /واسـتخرجت الفعالیـة النوعیـة وحـدة ،مللتـر/وتركیـز الـب ملغـم بـع مرتبطة والمرتبطة حیال كـل من الفعالیة األنزیمیة وقراءة العالقة الخطیة بین رقم الجزء المنفصل لكل من األجزاء غیر ال 2010) 3( 23 مجلة ابن الھیثم للعلوم الصرفة والتطبیقیة المجلد IHJPAS ول الموازنـة 280البروتین عند طول موجي مقداره نانومتر، بعدھا أجریت عملیة التنافذ الغشائي لألجزاء التي جمعت حیـال محـل .تالھـا تـركیز المحلول األنزیمي بالتجفید 6موالر ذي اس ھیدروجیني مقداره 0.05یوم الدارئ بتركیز خالت الصود Sتنقیة االنزیم بأستخدام المرشح الھالمي -بـ ephacryl S -200: ــي [17]أجریت خطوة التنقیـة وفقـا لمـا وصفـھ ـح الھالم Sephacryبأستعمـال عمود الترشـی l S-200 1.5ابعـاد ذي x ول األنزیمـي المحضـر بتركیـز 5إذ مـرر سم، 60 ن المحـل دارئ /ملغـم 20مللتـر ـم مللتـر باسـتعمال محلـول خـالت الصـودیوم اـل ول إذابـة وموازنـة 0.15والحاوي على كلورید الصودیوم بتركیز 6موالر ذي اس ھیدروجیني مقداره 0.05بتركیز موالر محـل سـاعة، وبعـد غسـل عمـود الترشـیح /مللتـر18 جزء وبسرعـة جریان مقـدارھا /مللتر3 صلة بواقع واسترداد وجمعت األجزاء المنف رأت األجـزاء المنفصـلة عنـد موجـة ضـوئیة طولھـا ول الموازنـة، ـق نـانومتر وقیسـت 280الھالمي بضعف حجمـھ بوسـاطة محـل ن القمـة الحاویـة ع/الفعالیة األنزیمیة وحـدة ر، ثـم جمعـت األجـزاء القریبـة ـم اس الفعالیـة مللـت ز وجـرى قـی ى فعالیـة أنـزیم الالیبـی ـل ین /مللتر واستخرجت الفعالیة النوعیة وحدة/مللتر وتركیز البروتین ملغم/األنزیمیة وحدة د رسـم العالقـة الخطیـة ـب ملغـم لألنـزیم بـع المتصاص الضوئي عند موجة طولھـا ألنزیمیـة و 280رقم الجزء المنفصل حیال كل من ا مللتـر، بعـدھا /حـدةنـانومتر والفعالیـة ا د 12أجریت عملیة التنافذ الغشائي للمحلول األنزیمي حیال الماء المقطر مدة ظ بدرجـة حـرارة التجمـی زیم وحـف م جفـد األـن سـاعة ـث .م-18 :تقدیر الوزن الجزیئي ي لألنـزیم المنقـى جزئیـا وفقـا للطریقـة ال ام بوصـفھا اتبعت تقانة الترشیح الھالمي في تقدیر الوزن الجزیـئ ي ـق ع [18]ـت ـم ــي ــل باسـتبدال مــادة الترشـیح الھالم ــھ أعـاله بمــادة Sephadex G-100إجـراء تحـویر تمث ــن المصــدر المشـار إلی ــتعملة م المس Sephacry l S-200 وزن أنفسـھاوباعتماد ظروف الفصـل د اـل ــي خطـوة التنقیـة بالترشـیح الھالمـي، وجـرى تحدـی ي اتبعـت ف الـت ي ألنـزیم الال ـ الجزیـئ ة تمثلـت ـب ـ ــوجود بروتینـات قیاسیــة مختلـف Lysozو Ovalbuminو Lactoferinو IgYیبیز ب y me يذ . كیلودالتون على التوالي 14.4و 42و 81و 180أوزان جزیئیھ تبلغ :استعمال انزیم الالیبیز في تحسین نكھة الدھن الحر دھن الحـر، إذ إذاستعمال أنزیم الالیبیز الفي [19]اتبعت الطریقة الموصوفة من ا لتحسـین نكھـة اـل 250یـب منقى جزئـی ن قمـاش الملمـل حاویـة علـى طبقـات قطنیـة غم من الزبد المنتج محلیا بوساطة التسخین، ثم رشح الدھن المذاب باستعمال قطعة ـم ین محكمـي الغلـیدعد ي دورـق دھن المرشـح ـف ع ة للتخلص من الشوائب المتبقیة والرواسب غیر المرغوب بھا، ووزع اـل 50ق وبواـق دوارق /مللتر ى أحـد اـل ى جزئیـا بتركیـز 5دورق، بعدھا أضیف إـل ر مـن اإلنـزیم المنـق ي /ملغـم 10مللـت مللتـر عـن طریـق إذابتـھ ـف دارئ بتركیـز داره 0.01محلـول خـالت الصـودیوم اـل دروجیني مـق الر ذي اس ھـی ــر 6مــو 0.22وتعقیمـھ باسـتعمال مرشـح بقط دارئ 5ني مایكرون، في حین أضیف للدورق الثا م ضـخ نفسـمللتر من المحلول اـل ى جزئیـا، ـث ي إذابـة األنـزیم المنـق ھ المسـتعمل ـف ي، تـاله الحضـن بدرجـة حـرارة ع النشـاط المیكروـب دة 37غاز النتروجین لكال الدورقین لمـن ك المسـتمر ـم ـع التحرـی سـاعة 48م م . ساعة على التوالي 48و 24و 12و 6موذج السیطرة خالل جرى خاللھا تقدیر الفعالیة األنزیمیة وتقییم رائحة الدھن المعامل وأن النتائج والمناقشة :تحدید المحلول االمثل الستخالص األنزیم ن كبـد الـدجاج ) 1(یبین الشكل روتین والفعالیـة النوعیـة ألنـزیم الالیبیـز المسـتخلص ـم اختالف الفعالیة األنزیمیة وتركیز الـب د باختالف محالیل االستخال ز كلورـی ادة تركـی ـد زـی ادة فـي الفعالیـة النوعیـة بشـكل واضـح عـن ص المستعملة، إذ یالحظ حصول زـی درائ بتركیـز ول االسـتخالص خـالت الصـودیوم اـل د أظھـرت النتـائج تفـوق محـل الصودیوم المضاف إلى محلول االسـتخالص، وـق ل االسـتخالص، 0.1بتركیز والحاوي على كلورید الصودیوم 6موالر ذي اس ھیدروجیني مقداره 0.05 موالر على بقیـة محالـی ول فعالیـة نوعیـة مقـدارھا و/وحـدة 3.55إذ أعطـى ھـذا المحـل ل االسـتخالص األخـرى محـل ي حـین أعطـت محالـی م ـف ــالت لملـغ خ درائ بتركیـز داره 0.05الصـودیوم اـل دروجیني مـق الر ذي اس ھـی د الصــودیوم 6مــو ى كلورـی ــاوي عـل ــول مـاء المقطـر الح ومحل .ملغم على التوالي/وحدة 1.41و 1.74و 2.22موالر ومحلول ماء المقطر فعالیة نوعیة مقدارھا 0.1ز بتركی ن المصـدر المسـتھدف، لـذا ـن األنـزیم بصـورتھ الحـرة والمرتبطـة ـم ى اكبـر كمیـة ـم ى الحصول عـل تھدف عملیـة االستخالص إـل م افضل تركیز لألنزیم و یجب أن یتم استعمال محلول استخالص یمكن من خاللھ الحصول على ى فعالیـة من ـث الحصـول علـى أعـل ل االسـتخالص قـدرتھا فـي تحریـر األنزیمـات مـن المصـادر المتواجـدة فیھـا و[20]نوعیـة ــجة السـیما ، وتسـتمد محالـی فـي األنس ل فضـال عـن تركیـز الري لألمالح المستعملة في تحضیر ھذه المحالـی كلوریـد الصـودیوم الحیوانیة والنباتیة من خالل التركیز المو ــا زاد التركیـز المـوالر ــن األنزیمـات المرتبطـة بنســیج يالـذي یضـاف إلیھـا، فكلم ى فـك ارتبـاط اكبــر قـدر ممكـن م أدى ذلــك إـل ى حصـول انخفـاض فـي الفعالیـة النوعیـة لألنـزیم يالمصدر، إال أن الزیادة في التركیز الموالر د یـؤدي إـل لمحالیل االسـتخالص ـق ى األنـزیم المستھدف نتیجة لتح ـج الحـاوي عـل ـي النسـی استخالصـھ الـذي یـراد رر كمیة كبیرة من البروتینات األخرى المتواجـدة ـف ي تحدیـد كفا) ملغـم/وحـدة(، لذا یجب أن تكون الفعالیة النوعیـة [21] د علیـھ ـف ة عملیـة االسـتخالص، كمـا یـؤدي یـالمعیـار المعتـم ي محلـول االسـتخالص وجعلـھ قلقـا و فين خالل تأثیره االس الھیدروجیني لمحلول االستخالص دورا مھما م زیم ـف ن ثبـات األـن ـم . [22]یسھل فك ارتباطھ من النسیج الحاوي علیھ ثم 2010) 3( 23 مجلة ابن الھیثم للعلوم الصرفة والتطبیقیة المجلد IHJPAS :تحدید الطریقة المثلى لتركیز االنزیم ى لترسـیب وتركیـز أنـزیم الالیبیـز استعمل الترسیب بمل د الطریقـة المثـل ح كبریتات األمونیوم والكحول االثیلي المبـرد لتحدـی حصـول ازدیـاد واضـح فـي الفعالیـة النوعیـة للراسـب یرافقـھ انخفـاض مالحـظ ) 2الشكل، (من المستخلص األنزیمي الخام، ویبین وم، ویالحـظ أن افضـل نسـبة إشـباع كانـت بمـدى في الفعالیة النوعیة للرائق عند تركیز األنـزیم باسـتعمال ملـح كبریتـات األمونـی ین راوح ـب ي حـین یشـیر %30-60یـت ى عـدم حصــول ازدیـاد واضـح فـي الفعالیـة النوعیـة للراسـب رافقـھ عــدم ) 3الشـكل، (، ـف إـل د ذا فـق ي، ـل طریقـة الترسـیب تاعتمـدحصول فقدان مالحظ للفعالیة النوعیة للرائق عنـد ترسـیب األنـزیم باسـتعمال الكحـول االثیـل ین ى فعالیـة نوعیـة مقـدارھا % 30-60بكبریتات األمونیوم لتركیز األنزیم بنسبة إشـباع تراوحـت ـب م مـن خاللھـا الحصـول عـل ـت .مرة 4.46في حین كان عدد مرات التنقیة % 62.74ملغم وحصیلة أنزیمیة بلغت /وحدة 22.19 تخلص تستعمل طرائق التركیز بملح كبریتات األ مونیوم والكحـول االثیلـي بشـكل واسـع فـي أول خطـوات التنقیـة لغـرض اـل أعلى كمیـة مـن المسـتخلص الخـام، یعقبھـا إجـراء ى األنـزیم ـب ن المـاء والبروتینـات المرافقـة والحصـول عـل من اكبر قدر ممكن ـم وة االیونیـةمثل التنقیة باالعتماد على خصائص األنـزیم داخل الكـاره للمـاء ،الـق ي ،واأللفـة ،والـت وزن الجزیـئ ، إال أن [3 ; 16]واـل ن األحمـاض األمینیـة نفسألنزیم یتباین حسب نوع المستخلص الخام واألنزیم اتأثیر ھذه المواد المستعملة في ترسیب ھ ومحتواه ـم م لترسـیب األنـزی ـز المالـئ ى والتركـی د الطریقـة المثـل ي تحدـی ــل [23]م واختالف شحناتھـا التي یكون لھا األثر الكبیر ـف د استعم ، فـق ن % 0-70ملح كبریتات األمونیوم بنسبة إشباع تراوحت بین [17] ن المستخلص الخام لعـف Rhizopلترسیب اإلنـزیم ـم us sp . ي حـین اسـتعمل 1.4وعدد مرات تنقیة % 49.7وحصال على األنزیم بحصیلة مقدارھا رة ، ـف وم [24]ـم ـح كبریتـات األمونـی مـل ــ ـــت ب ــباع تراوح ــب إش ــر % 35-60ینبنس ــن فط ــزیم م ــدارھا Trichoderma Virideلترســیب األن ــة مق ـة نوعی 328بفعالـی . ملغم/وحدة وني ى المبـادل االـی ــونیوم عـل ــح كبریتــات األم ـاستعمال مل ــرسیب ـب ـة الت -DEAEامرر األنـزیم المستحصـل علیـھ بعملـی Cellulose ـروتینیة عد) 4الشكل، (، ویشیر ـم ـب ـور قـم دإلـى ظـھ 0-1ة عنـد اسـترداد األنـزیم بالتـدرج الملحـي الخطـي بتركیـز ـی ن القمـة وتحدیـد الفعالیـة ع األجـزاء القریبـة ـم مـوالر من كلورید الصودیوم مع ظھور قمة واحـدة للفعالیـة األنزیمیـة، وجـرى جـم ن خطـوة التنقیـة ھـ ى األنـزیم ـم م وحصـیلة مقـدارھا /وحـدة 35.79ذه بفعالیـة نوعیـة بلغـت وتركیز البروتین وتم الحصول عـل ملـغ ــى عمـود الترشـیح الھالمـي 7.20وعدد مرات تنقیة % 60.52 ــرر الجـزء المستحصـل علیـھ عل Sephacry، ثم ام l S-200 إذ ، ى األنـزی) 5الشكل، (یظھر م الحصـول عـل روتین ترافقھـا قمـة واحـدة للفعالیـة األنزیمیـة، وـت م بفعالیـة نوعیـة وجود قمة واحدة للـب ن ) 1الجـدول، (مرة، ویبین 10.88وبعدد مرات تنقیة % 42.6وحصیلة بلغت 54.06مقدارھا خطـوات تنقیـة أنـزیم الالیبیـز ـم . كبد الدجاج المحلي ق عـد ــل یداستعملت طراـئ ـرشیح الھالمـي بمـادة [25]ة لتنقیة األنـزیم مـن مصادر مختلفـة، فقد استعم -Sephadex G الـت رة 200 ن خمـی DM(لتنقیـة األنـزیم ـم -2031(Candida rugosa ملغـم /وحـدة 64.35وحصـال علیـھ بفعالیـة نوعیـة مقـدارھا ألنزیم من الجراد باستعمـال الترشـیح الھالمـي بمـادة [18]مرة، كذلك استطاع 43وعدد مرات تنقیة -Sephadex Gمن تنقیة ا من تنقیة األنزیم مـن سمك البوري باسـتعمال [16]مرة، في حیـن تمكن 0.81ت تنقیة وعدد مرا% 21.84بحصیلة بلغت 100 ــادل االیـــوني بمــادة CMو DEAE-Celluloseالتب -Cellulose ــدارھا ــى % 2.95بحصــیلة مق ــل إل ــة وص وعــدد مــرات تنقی . مرة 18.55 تقدیر الوزن الجزیئي در الوزن الجزیئي ألنزیم الالیبیز با ح الھالمي باستعمال مادة ـق Sephacryتباع تقانة الترشـی l S-200 ــوجود بروتینـات ب ة تمثلـت بـــ ــ Lysozو Ovalbuminو Lactoferinو IgYقیاسـیة مختلف y me 14.4و 42و 81و 180أوزان جزیئیـة تبلــغ يذ الشـكل، (للبروتینـات القیاسـیة ) Ve(للدكسـتران األزرق وحجـم االسـترداد ) Vo(كیلودالتون على التوالي، وبعد تعیین حجم الفراغ ــترداد ، )6 ــم االس ــة بـین حج ــة الخطی ــم الفـراغ /Veرسـمت العالق ــیة Voحج ــات القیاس ــي للبروتین وزن الجزیئ ــاریتم اـل ــل لوغ مقاب .)7الشكل، (كیلودالتون 43.651الستخراج الوزن الجزیئي ألنزیم الالیبیز الذي بلغ ي الذي أشار إلى [16]جده جاءت ھذه القیمة مقاربة لما و وري كـان وزنـھ الجزیـئ ن سـمك الـب 46.5أن األنـزیم المنقـى ـم ــد تقــدیره ــا بلــغ كیلودالتــون عن ــل الماســخة، بینم ــائي بھــالم متعــدد االكریــل امایــد بوجــود العوام ــل الكھرب ــة الترحی 41.2بطریق ــد التقدیـــر ون عن ـح الھالمـــي كیلودالـت ـة الترشـی ود بطریـق ــد Sephadex G-50بعـم أن األنـزیم المنقــى مـن خمیــرة [26]، ووج Yarrowia lip olitica ي ــھ الجزیـئ ـغ وزن ین 48بل ي حــین ـب أن الـــوزن [27] كیلودالتــون مقـدرا بوسـاطة الترشــیح الھالمـي، ـف Penicillium cyclopالجزیئي لألنزیم المنقى من فطر ium غ ـة الترشـیح الھالمـي، 36بـل ــره بطریـق بینمـا كلیودالتون عنـد تقدی رة [28]أشـار ن خمـی ي لألنـزیم المنقـى ـم وزن الجزیـئ ى أن اـل Kurtإـل zmanomyces sp غ . ــة 49بـل دراً بطریق ون مـق كیلودالـت ي حـین وجـد ــى [29]الترحیل الكھربائي بھالم متعدد االكریل اماید بوجود العوامـل الماسـخة، ـف ي لألنـزیم المنق وزن الجزیـئ أن اـل Bacillus spمن بكتریا الكریل اماید بوجـود العوامـل كیلودالتون عند تقدیره 46 یبلغ . بطریقـة الترحیل الكھربائي بھالم متعدد ا .الماسخة 2010) 3( 23 مجلة ابن الھیثم للعلوم الصرفة والتطبیقیة المجلد IHJPAS :استعمال انزیم الالیبیز في تحسین نكھة الدھن الحر ي التغیر الحاصـ) 2الجدول، (یبین ن كبـد الـدجاج المحـل ى جزئیـا ـم ى أنـزیم الالیبیـز المنـق دھن الحـر الحـاوي عـل ي أنمـوذجي اـل ل ـف داره 0.01واألنموذج الحاوي على محلول خالت الصودیوم الدارئ بتركیز دة 7موالر ذي اس ھیدروجیني مـق 48بعـد الخـزن ـم ساعات على الحضن مـع عـدم حـدوث تطـور محسـوس 6ساعة، إذ یالحظ حدوث ارتفاع طفیف في الفعالیة األنزیمیة بعد مرور ملغـم رافقھـا /وحـدة 2.67سـاعة ارتفعـت الفعالیـة األنزیمیـة بشـكل ملحـوظ لتصـل 12في تغیر رائحة الدھن الحر، وبعد انقضـاء ي االرتفـاع لتصـل ب عـد حصول تغیر محسوس في رائحة الدھن الحر التي أصبحت رائحـة مقبولـة، وازدادت الفعالیـة األنزیمیـة ـف ى 12ملغم مع بقاء تطور رائحة الدھن الحر على حالھا التي وصلت إلیھا بعد مـرور /وحد 4.07ساعة إلى 24مرور سـاعات عـل ى 48الخزن، وبعد استمرار عملیة الحضن مدة ملغـم /وحـدة 0.07ساعة لوحظ حصـول انخفـاض فـي الفعالیـة األنزیمیـة لتصـل إـل .ساعة 12الذي تم الحصول علیھ عند الخزن مدة مع بقاء رائحة الدھن على حالھا المقبول دھن مـن خـالل یعود التغیر الحاصل في رائحة الدھن الحر المعامل باألنزیم إلى فعل أنزیم الالیبیز وتأثیره في تحسـین خـواص اـل ى إنتاجـھ لألحمـاض الدھنیـة والكلیسـیرول تحـت الظـروف الطبیعیـة دھن ممـا یـؤدي إـل ل المـائي لـل ، إال إن [30 , 4]قیامـھ بالتحـل د مـن األنزیمـات ذ 48انخفاض الفعالیة األنزیمیـة بعـد مـرور ى أن الالیبیـز یـع ود إـل ى اإلضـافة والخـزن یـع التفاعـل يسـاعة عـل ــة ــیریدات الثالثیـة مـن األحمـاض الدھنی ؤدي إلـى تكـوین الكلیس ــا ـی س التفاعـل عنــد عـدم وجـود المـاء مم وم بعـك المتعـاكس، إذ یـق .[5 , 2]االسترة الكلیسیرول بعملیة المصادر 1. Sammour, R. H. (2005). Purification and p artial characterisation of an acid lip ase in germinating lip idbody linseedlings. Turk. J. Bot . 29: 177-184. 2. Jaeger, K. E. and Eggert, T. (2002). Lip ases for biotechnology . Current Op inion in Biotechnology . Oxford. 13: 390-397. 3. Vakhlu, J. and Kou, A. (2006). Yeast lip ases: enzy me p urification, biochemical p rop erties and gene cloning. Electronic Journal of Biotechnology . 9(1): 69-85. 4. Shimizu, S. and Nakano, M . (2003). Structural characterization of triacy lglycerol in several oils containing gamma-linolenic acid. Biosci. Biotechnol. Biochem. 67: 60-67. 5. Saxena, R. K.; Sheoran, A.; Giri, B. and Davidson, W. S. (2003). Purification st rategies for microbial lip ase. J. M icrobiol. M ethods. 52(1): 1-18. 6. Kademi, A.; Lee, B. and Houde, A. (2003). Production of heterologous microbial lip ases by y east s. Indian Journal of Biotechnology . 2(3): 346-355. 7. Yang, X.; Wang, B.; Cui, F. and Tan, T. (2005). Production of lip ase by repeated batch fermentation with immobilized Rhizop us arrhizus. Process Biochemist ry . 40: 2095-2103. 8. Hiol, A.; Jonzo, M . D.; Rugani, N.; Druet, D.; Sarda, L. and Comeau, L. C. (2000). Purification and characterization of an extra cellular lip ase from a thermop hilic Rhizop us ory zae st rain isolated from p alm fruit. Enzy me and M icrobial Technology . 26: 421-430. 9. Fomuso, L. B. and Akoh, C. C. (2001). Enzy maticalic modification of high laurate canola to p roduce margarine fat. J. Agric. Food. Chem. 49(9): 4482-4487. 10. Leon, A. E.; Duran, E. and Benedito, B. C. (2000). Utilization of enzy me mixtures to retard bread crumb friming. J. Agric. Food. Chem. 50(6): 1416-1419. 11. Cox, M .; Gerritse, G.; Dankmey er, L. and Quax, W. J. (2001). Characterization of the p romoter and up st ream activating sequence from the Pseudomonas alcaligenes lip ase gene. J. Biotechnol. 86(1): 9-17. 12. Lopez-Amay a, C.; M arangoni, A. G.; Haard, N. F. and Simp son, B. K. (2001). Lip ase: Seafood Enzy me. Ut ilization and Influence on Postmorten Fish Quality . M arcel Dekker, NY. 121-146. 13. Park, E. Y. and Pizarro, A. V. L. (2003). Lip ase-catalysed p roduction of biodiesel fuel from vegetable oils contained in waste activated bleaching earth. Process Biochemist ry . 38: 1077- 1082. 14. Lin, S. F.; Chiou, C. M . and Tsai, C. Y. (1995). Effect of T riton X-100 on alkaline lip ase p roduction by Pseudomonas p seudoalcaligenes F-111. Biotechnology letters. 17(9). 959-962. 15. Bradford, M . M . (1976). A rap id and sensitive method for the quantitation of microgram 2010) 3( 23 مجلة ابن الھیثم للعلوم الصرفة والتطبیقیة المجلد IHJPAS quantities of p rotein utilizing the principle of p rotein-dy e binding. Anal. Biochem. 72: 248- 254. 16. Islam, M . A.; Absar, N. and Bhuiy an, A. S. (2008). Isolation, p urification and characterization of lip ase from Grey mullet (Liza parsia Hamilton,1822). Asian. J. Biochem. 3(4): 243-255. 17. Koblitz , M . G. B. and Past ore, G. M . (2006). Purification and biochemical characterization of an extracellular lip ase produced by a new strain of Rhizop us sp . Cienc. agrotec. Lavras. 30(3): 494-502. 18. Orscelik, O.; Akp inar, M . A. and Gorgun, S. (2007). Partial Purification of Tot al Body Lip ase from Gry llus camp estris L. (Orthop tera: Gry llidae). Fen. Bilimleri. Dergisi. 28(2): 1-10. Lipبعض التطبیقات العملیة النـزیم الالیبیـز ). 2005. (التمیمي، سحر غازي عمران عبد الواحد. 19 ase ن المسـتخ لص مـن عـف Asp ergillus niger .الجامعة المستنصریة. كلیة العلوم. رسالة ماجستیر . 20. Kornberg, A. (1990). Why Purify Enzy mes. In: M ethods in Enzy mology . (eds, M . P. Deutscher). Academic Press. New York. 182: 1-5. 21. M unoz, R. and Barcelo, R. A. (1995). Enzy mes. In: Hand Book of Food Analy sis. (eds, Nollet, L. M . L.). M arcel Dekker. New York. 2: 317-319. 22. Whitaker, J. R. (1972). Principle of Enzy mology for Food Sciences. M arcel Dakker, Irc. New York. 23. Beisson, F.; Tiss, A.; Rivire, C. and Verger, R. (2000). M ethods for lip ase detection cnd assay : a critical review. European Journal of Lipid Science and Technology . 133-153. 24. Kashmiri, M . A.; Adnan, A. and Butt, B. W. (2006). Production, p urification and p artial characterization of lip ase from Trichoderma Viride. African Journal of Biotechnology . 5(10): 878-882. 25. Benjamin, S. and Pandey, A. (2001). Isolation and characterization of three distinct forms of lip ases from Candida rugosa p roduced in solid st ate fermentation. Brazilian Archives of Biology and Technology . 44(2): 213-221. 26. Aloulou, A.; Rodriguez, J. A.; Puccinelli, D.; M ouz, N.; Leclaire, J.; Leblond, Y. and Carriere, F. (2007). Purification and biochemical characterization of the LIP2 lipase from Yarrowia lip olytica. Biochem. Biophy s. Acta. 1771: 228-237. 27. Yu, M . S. Q. and Tan, T. (2007). Purification and characterization of the extracellular lip ase Lip 2 from Yarrowia lip olytica. Process Biochem. 42: 384-391. 28. Kakugawa, K.; Shobayashi, M .; Suzuk, O. and M iyakawa, T. (2002). Purification and charecterization of lip ase from glycolipid p roducing y east Kurt zmanommy ces sp . Biosa. Biotechnol. Biochem. 66(5): 978-985. 29. Helist o, P.; Akt uganov, G.; Galimzianova, N.; M elentjev, A. and Korp ela, T. (2001). Ly tic enzy me comp lex of an antagonistic Bacillus sp . X-b: Isolation and purification of component. J. Chromatograph. 758: 197-205. 30. Gandhi, N. N. and M ukherje, K. D. (2000). Papaya (Carica papaya L.) Lip ase with some distinct acy l and alky l sp ecificities as compared. Biochem. Soc. Ttans. 28(6): 977-987. 2010) 3( 23 مجلة ابن الھیثم للعلوم الصرفة والتطبیقیة المجلد IHJPAS الدجاج خطوات تنقیة إنزیم الالیبیز من كبد): 1(جدول الخطوة الحجم )مللتر( ــــة ــ ــ ــ ــ ــ الفعالی األنزیمیة )مللتر/وحدة( ـــز ــ ــ ــ ــ ــ تركیــ البروتین )مللتر/وحدة( ــــة ــ ــ ــ ــ الفعالیــ النوعیة )ملغم/وحدة( ـــة ــ ــ ــ الفعالی الكلیة )وحدة( ــدد ــ عـــ مـــرات التنقیة الحصیلة (%) 100 1 343 4.97 0.69 3.43 100 المستخلص الخام ـــات الترســــیب بكبریـت )30-60%(األمونیوم 10 21.52 0.97 22.19 215.2 4.46 62.74 التبادل االیوني DEAE-Cellulose 52 20 10.38 0.29 35.79 207.6 7.20 60.52 الترشیح الھالمي Sephadex G-100 15 9.73 0.18 54.06 145.95 10.88 42.6 .تأثیر اضافة االنزیم في تحسین خواص الدھن الحر): 2(جدول الرائحة )مللتر/وحدة(الفعالیة لنماذجا الوقت ساعات 6بعد بدون تغیر - دھن حر مع دارئ الخالت بدون تغیر 1.75 دھن حر مع األنزیم ساعة 12بعد بدون تغیر - دھن حر مع دارئ الخالت مقبولة 2.67 دھن حر مع األنزیم ساعة 24بعد بدون تغیر - دھن حر مع دارئ الخالت مقبولة 4.07 األنزیم دھن حر مع ساعة 48بعد بدون تغیر - دھن حر مع دارئ الخالت مقبولة 0.07 دھن حر مع األنزیم :تحدید الطریقة المثلى الستخالص أنزیم الالیبیز من كبد الدجاج المحلي باستعمال محالیل استخالص عدة شملت): 1(شكل A :ماء مقطر. B : موالر 0.1على كلورید الصودیوم بتركیز ماء مقطر حاوي. C : 6موالر ذي اس ھیدروجیني مقداره 0.05كمحلول خالت الصودیوم الدرائ بتركیز. D : ز درائ بتركـی ــودیوم اـل ـول خـالت الص دروجیني مقـداره 0.05محل ــودیوم 6مــوالر ذي اس ھـی ــاوي علـى كلوریـد الص والح . موالر 0.1بتركیز 2010) 3( 23 لوم الصرفة والتطبیقیة المجلدمجلة ابن الھیثم للع 0 1 2 3 4 5 وكوز كل سكروز لكتوز كا لتوز ما ركیز (%2.5) ون بت رب الكا ر مصد الفعالیة النوعیة ) مللتر/ملغم(تركیز البروتین ) مللتر/وحدة(الفعالیة ص محالیل االستخال A B C D ة لی عا لف ا ) دة ح و / تر ملل ( ة عی و لن ا یة عال لف ا ) دة ح و / غم مل ( كی تر ن تی و بر ال ز ) غم مل / تر ملل ( IHJPAS الترس�یب الت��دریجي ألن�زیم الالیبی��ز م�ن مس�تخلص كب��د ال�دجاج باس��تعمال مل�ح كبریت�ات األمونی��وم بنس�ب إش��باع ): 2(ش�كل %.20-90تراوحت بین �ن مس�تخلص كب�د ال�دجاج باس�تعمال الكح�ول االثیل�ي المب�رد ذي تركی�ز الترسیب الت�دریجي ألن�زیم الالیبی�ز): 3(شكل % 98م %.20-80للحصول على نسب مئویة متدرجة من الكحول تراوحت من 2010) 3( 23 مجلة ابن الھیثم للعلوم الصرفة والتطبیقیة المجلد 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 10 20 30 40 50 60 70 8 0 9 0 100 (%)نسبة التركیز نتاتاالبا ع و لن ا یة عال لف ا ق ائ لر ل یة ) دة ح و / غم مل ( ب س را لل یة ع و لن ا یة عال لف ا ) دة ح و / غم مل ( ب ق الفعالیة النوعیة للراس الفعالیة النوعیة للرائ 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 (%)نسبة اإلشباع نتاتاالبا ق ائ لر ل یة ع و لن ا یة عال لف ا ) دة ح و / غم مل ( ب س را لل یة ع و لن ا یة عال لف ا ) دة ح و / غم مل ( قالفعالیة النوعیة الفعالیة النوعیة للرائ %60-30 IHJPAS DEAE-Ceز من كبد الدجاج باستعمال كروماتوغرافي التبادل االیوني بعمود تنقیة أنزیم الالیبی): 4(شكل llul ose .جزء منفصل/مللتر 3.5ساعة بواقع /مللتر 42سم وسرعة جریان مقدارھا x 30 1.5 ذي أبعاد Sالم�ي بعم�ود تنقیة أنزیم الالیبیز من كبد الدجاج باستعمال كروم�اتوغرافي الترش�یح الھ): 5(شكل ephacryl S ذي 200- .جزء منفصل/مللتر 3ساعة بواقع /مللتر 18سم وسرعة جریان مقدارھا x 60 1.5 أبعاد 2010) 3( 23 مجلة ابن الھیثم للعلوم الصرفة والتطبیقیة المجلد 0 0. 1 0. 2 0. 3 0. 4 0. 5 0. 6 0. 7 0. 8 0. 9 1 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 نتاتاالبا 0 0 .1 0 .2 0 .3 0 .4 0 .5 0 .6 0 .7 0 .8 0 .9 1 رقم الجزء المنفصل نومتر 208االمتصاصیة على )مللتر/وحدة(الفعالیة األنزیمیة نا ى عل ة صی صا مت ال ا 2 8 0 تر وم ان ن ة می زی الن ا یة عال لف ا ) ح و /دة ر لت مل ( 1 0 x ي ط خ ال ي ح مل ال ج در لت ا 0 0.5 1 1.5 0 10 20 30 40 50 0 5 10 15 ى عل ة صی صا مت ال ا 2 8 0 تر وم ان ن ة می زی الن ا یة عال لف ا ) دة ح و / ر لت مل ( رقم الجزء المنفصل نومتر 208االمتصاصیة على )مللتر/وحدة(الفعالیة األنزیمیة نا IHJPAS Lactoferinو IgYللبروتین�ات القیاس��یة ) Ve(زرق وحج��م االس�ترداد للدكس�تران األ) Vo(تعی�ین حج��م الف�راغ ): 6(ش�كل Ovalbumiو n وLysoz yme وLipase. Sالمنحنى القیاسي لتقدیر الوزن الجزیئي ألنزیم الالیبیز المنقى جزئیا بتقنیة الترشیح الھالم�ي بم�ادة ): 7(شكل ephacryl S Ovalbumiو Lactoferinو IgYبوجود 200- n وLysoz yme كبروتینات قیاسیة . 0 0.5 1 1.5 0 10 20 30 40 50 0 5 10 15 ى عل ة صی صا مت ال ا 2 8 0 تر وم ان ن ة می زی الن ا یة عال لف ا ) دة ح و / ر لت مل ( رقم الجزء المنفصل Lysozyme Ovalb umin Lactoferin IgY Lipase Blue Dex tran نومتر 208االمتصاصیة على )مللتر/وحدة(الفعالیة األنزیمیة نا 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 2.0 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 4 .0 4 .1 4 .2 4. 3 4. 4 4. 5 4. 6 4.7 4.8 4.9 5.0 5.1 5 .2 5 .3 5 .4 5 .5 5 .6 5 .7 5 .8 )log M.W(لوغاریتم الوزن الجزیئي د ردا ست ال ا جم ح ) V e / ( غ را لف ا جم ح ) V o ( Ovalb umin Lactoferin Lysozyme IgY Lipase IHJPAS IHJPAS