الصرفة والتطبیقیة المجلد 2009) 4 (22مجلة ابن الھیثم للعلوم Serratia marcescenceدراسة دور بروتینات الغشاء الخارجي لبكتریا في المقاومة للمضادات الحیویة هناء سلیم یوسف جامعة بغداد، كلیة العلوم،قسم علوم الحیاة الخالصة خیصیة على عشر عزالت من بكتریا بعد اجراء حساسیة يجرأ Serratia marcescenceالفحوصات التشی فحص ال فة تا الكتام لجمیع العزالت،للمضادات الحیویة المختل ز االنزیم المحلل لمضادات بی . و فحص القابلیة على افرا یخذ معدل كمیة البروتین ألربع عزالأ عزلت بروتینات الغشاء الخارجي و ت و عزلت ة للمضادا كثر مقاوم ن اقل ت األ من خالل الدراسة وجد ان بكتریا .مقاومة للمضادات تحت األختبار مقاومة عالیة لمدى واسع من وذ S.marcescence و قاومة تعود ،المضادات الحیویة ت الغشاء الخارجي عدیدةعواملل و ان هذهذ الم الشتراك مع بروتینا و مثل افراز البنسلینیز با عوامل متآزرة مع بعضها لمقاومة المضادات الححیویة و منع تأثیرها .ِتعمل هذه ال المقدمة لمرضیة من اهمیة طبیة في العقدین األخیرین لمالهاS.marcescence اكتسبت بكتریا دور في احداث االصابات ا هابات المجاري البول، التهابات الحروق و الجروح: مثل،المختلفة رة والسیما و،یة و الت المراض الخطی رها من ا الشخاص غی في ا یات .[1]ذوي المناعة الضعیفة و الراقدین في المستشف اومتها لمدى واسع من المضادات الحیویة S.marcescence ان االصابة الناجمة عن بكتریا صعبة العالج بسبب مق دات الحیویة اذ ،[2] ِ في مقاومة هذه "ا كبیر"ا دور[4] و بروتینات الغشاء الخارجي ،[3]تلعب االنزیمات المثبطة للمضا لحیویة لبكتریا [5] و جماعته Palomer فقد بین الباحث .المضادات مضادات ا النفاذیة لل بسبب الغشاء S.marcescence ان نبیة ) O) O-somatic antigenالخارجي یعتمد على المستضد الجسمي رات (O-side chain)و السلسلة الجا و ان الطف M)التي ینقصها هذا المكون تمتاز بانخفاض قیمة التركیز المثبط االدنى IC)و ، لمضادات البیتاالكتام مقارنة بالعزالت االبویة ثبط االدنى(O)ان استرجاع المستضد و قد بین الباحث على ان النفاذیة تعتمد على المستضد . یستعید قیمة التركیز الم المقاومة للبنسلینات و منها [6] و جماعته Ito ذكر الباحث بینما. Oالجسمي م (Imipenem) ان یعود الى انتاج انزی M etallo-β-Lactamase بین الباحث ان Nikaido [8] و ([7]) و جماعته chong المحمول على البالزمید في حین ارجي و ه الموجو(Porine)المقاومة تعود الى بروتینات . تمنع مرور المضادات"ا نفاذی"احاجزي تعمل دة في الغشاء الخ الصرفة والتطبیقیة المجلد 2009) 4 (22مجلة ابن الھیثم للعلوم المواد و طرائق العمل االوساط الزرعیة ة هي M وNutrient agar و Nutrient brothاالوساط الزرعی acChonkey agarو M uller Hinton Agarاقراص و .ادات الحیویةالمض العزالت بات الحروقحصول على العزالت من المصادر اآلت تم ال و ،و عزلتان من حصى الكلیة، و الجروح،یة عزلتان من التها ة و ثالث عزالت من البیئة الخارجیة ).تجمعات مائیة مؤقتة(ثالث عزالت من التهابات المجاري البولی التشخیص مجهریة فضاللروتینیة باالعتماق اائ تم التشخیص بالطر اجریت . الى الفحوصات البایوكیمیائیةعن" د على الفحوصات ال مال نظام م التأكد من التشخیص باستع معتمدة وت ماورد في انظمة التشخیص ال مادا على EPI 20Eًاالختبارات اعت (Biomerux). .[9]مضادات الحیویة و مقارنة النتائج بالمصدر ألختبار الحساسیة لل(Baure-Kirby) استعملت طریقة كیربي تاج انزیم البنسلینیز حسب المصدر S.marcescence نقل قطرة من معلق كثیف لبكتریا بأختصارو ، [10]اجري فحص ان سم0.1النقیة الى انبوبة تحتوي على 3 ین سم/ مكغم6.000 بتركیز G من محلول مضاد البنسل 3 غرفة رة ال و تركت بدرجة حرا لنشا المائي بتركیز ان ثم اضیف لها قطرت،مدة نصف ساعة (1 من محلول ا من محلول ،)حجم/وزن% بعد ذلك اضیف قطرة الزرق الى االبیض خالل اقل من یر اللون ا بوبة و مزجت جیدا و لوحظ تغ دقائق و هذا دلیل على انتاج 10ًالیود الى االن .االنزیمات المحللة لمضادات البیتاالكتام ستخالص و تقدیر بروتینات الغشاء الخارجيا ماورد في المصدر على تمت الطریقة سم1 نقل اذ ،(Osborn,1980) [11] وفق 3 ائلة بعمر ساعة 18 من مزرعة س بحرارة . السائل الى لتر واحد من وسط نقیع الدماغ والقلب . ساعة 18 و مدة ˚ م37حضن الدورق علقت الخالیا . ˚ م4 و حرارة (g×8000) دقیقة بسرعة 30 جهاز الطرد المركزي مدة خدام باست جمعت الخالیا بعد الحضن مركزي ،و غسلت ثالث مرات باستخراج محلول الملح الفسیولوجي طرد ال الق باستخدام جهاز ال نبذ الع ة السابقةب و تم الطریق ساعة و 24 و مدة ˚ م40وضعت في الحاضنة بحرارة جففت الخالیا بوضعها في انبوبة صغیرة مغلقة بسداد قطني و. نفسها سم10 ملغم من الخالیا البكتیریة الجافة في 10استخلصت بروتینات الغشاء الخارجي بتعلیق 3 ظم من المحلول الملحي المن Tris-HCl Buffer ة الحموضة قیمتها تساوي 0.05 بتركیز 1 بتركیز EDTA الحاوي على (pH=7.8) 7.8 موالر و دال ا باستخدام. ˚ م4لي موالر ألزالة المواد الالخلویة و بحرارة م (Ultrasonic) جهاز الترددات فوق الصوتیة حطمت الخالی مرات 15ثانیة لمدة / ذبذبة 24.000بتسلیط اظ على حرارة مع مدة، و كررت العملیة اربع د المحلول للحف ، ˚ م4 توقف لتبری ي . ˚ م4 لمدة ساعة بحرارة g×6000 الطرد المركزي المبرد بسرعة فصل الراشح عن الراسب باستخدام جهاز ب الراسب ف اذی مقدارها 0.05 بتركیز (Tris-HCl)المحلول المنظم ترس الحامضي مال . 8- 7 موالر و دالة حموضة تم تركیز البروتین باستع .مال لحین االستع˚ م20-طریقة الفرز الغشائي و استعمال السكروز و تم الحفظ بحرارة : و باستخدام المعادلةWitakar & Granum كمیة البروتین باستعمال طریقة تس قی الصرفة والتطبیقیة المجلد 2009) 4 (22مجلة ابن الھیثم للعلوم سم/ملغم(تركیز البروتین 3 ة بطول موجي)= nm280 االمتصاصیة بطول موجي– nm235االمتصاصی 2.51 شة النتائج و المناق ستنادا الى التشخیص مكونكي ا ق ائ الى الطرشكل المظهري و المجهري و فضال عن ً العزالت المنماة على وسط آكار ال نتائج مطابقة لطر. APIE20الكیمیائیة و تم تأكید التشخیص باستعمال نظام ق التشخیص المعتمدة و بكتریا ائو قد جاءت ال Serratia marcescenceة تنتمي الى ع ها بروتینات الغشاء دور في مق اذ تؤديEnterobacteriaceae ائل اومت مقاومة ضمن افراد العائلة عن" للمضادات الحیویة فضال الى امكانیة انتقال بلزمیدات ال [13]. عزالت كانت فارزة النزیم نسلینات جدول β-Lactamase من خالل الدراسة وجدنا ان جمیع ال . )1( الذي یثبط الب مرضیة كانت فاقدة لملون و هي تحتل Prodigiosinو من خالل الجدول نفسه نالحظ ان معظم العزالت المأخوذة من حاالت ة ،من مجموع العزالت المرضیة% 71.4نسبة من عزالت % 66 بینما كانت نسبة ،%28.5 في حین الفارزة للملون تحتل نسب ى افرا مطابقالبیئة الخارجیة و تمتلك القابلیة عل مرضیة بین ان العزالت ا، اذ[14] لما حصل علیه "از الملون و هذا ماجاء ل و ملح الطعام و ،الحضنحرارة و درجة ، ان لظروف الزرع15]، 16[ و قد اوضحت الدراسةُغالبا ماتكون فارزة للملون ها عوامل تؤثر ،االیونات عزالت المرضفي و الضوء كل ب ال ت فاقدة للملون لذلك الیعدی افراز الصبغة و بما ان اغل الملون ة كان .[14] عامل فیاعة للبكتریا ة عن بكتریا السالبة ا اعتمد في الدراسة على المضادات المتو ة المتسبب تعملة لعالج الحاالت المرضی ق و المس فرة في االسوا .رامگلملون المقاومة ناجمة عن سوء ِ و ان هذه، الحیویةنجد ان هناك مقاومة متعددة لغلب المضادات) 2( عند مالحظة جدول بطة للمضادات كماانها استعمال المضادات الحیویة التي تسبب في انتقاء العزالت المقاومة و التحفیز على افراز االنزیمات المث ا یبه الكیمی ر في ترك سماحئيتؤدي الى تغییر في نفاذیة الغشاء الخارجي بسبب تغی ى عدم ال ي یؤدي ال للمضاد بالنفاذ او و الذ رابع فعالة ضد بكتریا ] 7،8 [تثبیط المضاد بحیث الیعمل على البكتریا S.marcescence و ان سیفالوسبورینات الجیل ال یز .]18، 17[بسبب قلة االلفة بینها و بین انزیم البنسلین ت التي ینقصها السلسلة الجانبیة Palomar كما اوضح ل قیمة تO و جماعته ان الطفرا لذلك اشار الى دور MICsقل .[5] في نفاذیة المضادات عبر الغشاء الخارجيOالسلسلة ِلمضاد الجنتامایسین و تعزى هذه % 100مضادات االمینوكالیكوسایدات فیالحظ ان هنالك مقاومة الى اما بالنسبة ر هعن" فضالالمقاومة اذیة الى وجود انزیمات تعمل على تحوی ِذه المضادات و هذه االنزیمات محمولة على حاجز النف ِ ل [3] البالزمید و یمكن انتقائها بین افراد العائلة ر على مضادات االمینوكالیكوساید مث و ان االنزیمات المثبطة التي تؤث .20Kb-10ُالجنتامایسین و االمیكاسین تكون محمولة على بالزمید یتراوح حجمه الصرفة والتطبیقیة المجلدمجلة ابن الھیثم للعلو 2009) 4 (22م عددة المقاومة هو Amikacinل ان مضاد ا) 2( من الجدول نالحظ نالحظ اقل مقاومة .االنسب لعالج حاالت البكتریا المت ِ و ال یقتصر استعمالها ضد هذه البكتریا Cephtriexone و Cephotaximكانت للجیل الرابع من السیفالوسبورینات و هو .]17[فقط و انما یستعمل لجمیع افراد عائلة البكتریا المعویة صعبة العالج نا ان اكثر العزالت مقاومة و هي )3( جدول قیاس كمیة بروتین الغشاء الخارجيالى بالنسبة ، S1 ، S4 ، S5 وجد S10توا 2.56 و معدل كمیة البروتین لها كانت 2.51 ، 2.07 ، 2.97 ، 2.71لي كمیة البروتین لها كانت على ال سم/مكغم 3 تائج موافقة ت هذه الن ة للمضادا یة المقاوم ز الملون و هي عال ة على افرا یمة القابلی میعها عد ِ و هذه العزالت كانت ج ِ .]14 [للنتائج التي حصل علیها عزالت االقل مقاومة نسبیا غشاء S9 و S2للمضادات الحیویة و هي ًفي حین ان ال فارزة للملون و كمیة بروتینات ال و هي اقل من كمیة بروتینات الغشاء الخارجي للبكتریا 1.71 و معدل كمیة البروتین 1.65 ، 1.78الخارجي كان على التوالي دة للملون .الفاق ة على احداث االصابة لالشخاص ذوي المناعة الضعیفة و هي بكتریا انتهازیة لها القابلی S.marcescence ان بكتریا كتریا المعویة ة من افراد عائلة الب ت المقاوم تقال جینا بلیة على اكتساب المقاومة ألغلب المضادات الحیویة عن طریق ان لها القا فاذیة ة الن ء الخارجي لتصبح قلیل غشا نات ال .]19 [االخرى كما تمتلك القابلیة على تحویر بروتی مواد اساس مختلفة و ان نتاجیة و فعالیة هذه Multidrug efflux pumps كما ان بروتینات نظام ِ تعمل على ر عدیدةعواملبالبروتینات تتأثر ن انتاجها یكون كبی م یعتمد على الطاقة و قد وجد و ان هذا النظا، في السالالت الممرضة"ا و ا لسالالت الممرضة "انه یؤدي دورا لطاقة و قد وجد انه ،في ا یعتمد على ا في مقاومة "یا اساس"ادوریؤدي و ان هذا النظام Pseudomonas aeroginosaعائلة المعویة . و بقیة افراد ال ِ لعالج االصابات الناجمة عن هذه البكتریا متعددة المقاومة یستعمل خلیط من مضادین او اكثر مثل مضاد من مجموعة نما یقوم مضاد البیتاالكتام بمنع اعادة النمو ،یدات فاالمینو كالیكوسایدات تحفز القتل السریع و اختزال الطعماالمینوكالیكوسا بی ]20[. المصادر 1. Korner,R.J.; Nicol, A. and Reeves, D.S.(1994). Ciprofloxacin resistant Serratia marcescence endocarditis as a complication of non-Hodgkin's lymphoma. J.infect. 29:73- 76. 2. Sleigh,J.D.(1983).Antibiotic resistance in Serratia marcescence. BM J.287:1651-1653. 3. Garcia,D.C.; Woloj,G.M .; Pileiro,S. and Sordelli,O.(1995). An 8-years study of resistant to amikacin in gram-negative bacilli isolated from patient with nosocomial infections at one hospital in Argentina.J.M cd.Microbiol.42:283-390. 4. Nikaido,H.(1994).Prevention of drug access to bacterial targets : Permeability barriers.Science.15:382-388. 5. Palomars,J.: Puig,M.; M ontilla, R. and Loren JG.(1995). Lipopolysaccharide recovery restores susceptibility levels towards β-lactamase in S. marcescence. M icrobios.82:21-26. الصرفة والتطبیقیة المجلد 2009) 4 (22مجلة ابن الھیثم للعلوم 6. Ito, H. ; Arakawa,Y.; Ohsuka,S. and Wacharotayankum,R. (1995).Plasmid-mediated dissemination of the metallo-β- lactamase gene blatmp among clinically isolated strains of Serratia marcescence. Antimicrobial Agents Chemoth.39:824-829. 7. Chong,Y.; Lee,K.; and Kwon O.H.(1993).Invitro activities of cefepime against Enterobacter cloacae, S. marcescence, Pseudomonas aeruginosa and other aerobic Gram- negative bacilli.I.Antimicrob.Chemoth.32 Suppl.B:21-29. 8. Nikaido,H.; Liu,W.; and Rosenberg,E.Y.(1990).Outer membrane permeability and β- lactamase stability of dipolar ionic cephalosp orins containing methaloxyimmo substituents.Antimicrob Agents.Chemoth.34:337-342. 9. National Committee for Clinical Laboratory Standars (NCCLs).(1989).Peromance standars for antibacterial susceptibility testing. 10. Roseblatt ,J.E. and Neumann.(1978).A rapid test for pencillinase. Am.J. Clin.Pathology.89:351-354. 11. Osborn, M . J. and Wu ,H.C.(1980).Proteins of the outer membrane of gram negative bacteria Ann.Rev.Microbiol. 34:369-422. 12. Witakar,R.J. and Grannum,P.E.(1980).An absolute methand for protein determination based on deference in absorbance 235 , 280.Anal.Biochemisery .109:156-159. 13. Grimont, PAD , Grimont,F.(1984). Serratia in Krieg, N.R. Holt, J.G.(eds) Bergey 's M annual of systematic bacteriology Vol.I. Baltemore, Williams and Wilkins.477- 484. 14. Philips,I. and King A.(1977). Serratia marcescence in hosp ital practice.Lancet 1, 538. 15. Williams, R.P.; Gott C.L.; and Qadri,S.M.H.(1971).Influence of temper true of incubation and type of growth medium on pigmentation in Serratia marcescence . J.Bacteriol.106:438-443. 16. Silverman, M.P. and M unoz,E.F.(1973).Effect of iron and salt on p rodigiosin synthesis in Serratia marcescence .J.Bacteriol.114,999-1006. 17. Bellido,F.; Pechere,J.C. and Hancock,R.E.W.(1991).Novel method for measurement of outer membrane permeability to new β-lactamase in intact Enterobacter cloacae cells Antimicrob. Agents,Chemother.35,68-72. 18. De Champs,C.; Henqwell,C. and Guelon,D.(1993).Clinical and bacteriological study of nosocomial infection due to Enterobacter aerogenes resistant to impenem.Clinic M icrob.13:123-127. 19. Nikaido,H.(1989).Outer membrane barrier as a mechanism of antimicrobial resistance.33(11):1831-1836. 20. Carbon,C.(1991).Impact of the antibiotic dosage schedule of efficacy in experimental endocarditis. J.Infect.Dis.supp.74:164-172. الصرفة والتطبیقیة المجلد 2009) 4 (22مجلة ابن الھیثم للعلوم β-Lactamase و انزیمات Prodigiosin على افراز ملون S.marcescence قابلیة عزالت :)1(جدول یة على افراز ملون مصدر العزلة رقم العزلة القابل Prodigiosin ت یة على افراز انزیما القابل β-Lactamase + - التهاب الحروق 1 + + التهاب الجروح 2 كلیة 3 + - حصى ال + - حصى لكلیة 4 + - التهاب المجاري البولیة 5 + + التهاب المجاري البولیة 6 + - التهاب المجاري البولیة 7 + + بیئة خرجیة 8 + + بیئة خارجیة 9 + - بیئة خارجیة 10 )9(ًللمضادات الحیویة المختلفة استنادا للمصدر S.marcescenceیة بكتریا حساس:)2(جدول تركیز المضاد المضاد الحیوي قرص/مكغم ت الحساسة العزال (%)العدد عزالت متوسطة (%)الحساسیة العدد اومة العزالت المق (%)العدد Ampicillin 10 (0.0)0 (0.0)0 (100)10 Amoxycillin 25 (30)3 (10)1 (60)6 Amikacin 30 (40)4 (40)4 (20)2 Gentamicin 10 (0.0)0 (0.0)0 (100)10 Nalidixic acid 30 (30)3 (30)3 (40)4 Cephalexin 30 (30)3 (20)2 (50)5 Cephotaxime 30 (40)4 (40)4 (20)2 Cephtricxone 30 (70)7 (20)2 (10)1 الصرفة والتطب 2009) 4 (22یقیة المجلدمجلة ابن الھیثم للعلوم سم/ مقاسة بالمكغم S.marcescence كمیة البروتین في الغشاء الخارجي لبكتریا :)3(جدول 3 ة البروتین العزلة كمی S1* 2.71 S2 1.78 S3* 2.35 S4* 2.27 S5* 2.07 S6 3.07 S7* 2.44 S8 1.05 S9 1.65 S10* 2.51 IBN AL- HAITHAM J. FOR PURE & APPL. S CI. VOL.22 (4) 2009 Study of the Role of the Outer Membrane Proteins of Serratia marcescence in Resistant to Antibiotics H. S. Yossef Department of Biology , College of Science , University of Baghdad Abstract After diagnostic tests on ten isolates of S. marcescence, were made an examination of sensitivity to various antibiotics and checking the ability to produce β-lactamase of all isolates. The outer membrane protein quantity was determined in μg/cm 3 for all isolates. The results showed that S. marcescence have antibiotic multiresistant and all isolates had the ability to produce β-lactamase and its resistance may arise from more than two mechanisms like overproduction of antibiotic inactivation enzymes and the decrease of permeability by outer membrane protein.