IBN AL- HAITHAM J. FO R PURE & APPL. SC I VO L.22 (3) 2009 Purification of Fungul Glucoamylase and Study the Effect of Concentration And Thermal Processing on Enzymatic Activity of Starch Hydrolysis M. K. M. Jwaid Department of Chemistry, College of Education, Ibn Al-Haitham, University of Baghdad Abstract Glucoamylase from black Aspergillus niger isolate was purified by ammonium sulfate precipitation and sephadex G 200 filtration. A trial for the purification of glucoamylase resulted in an enzyme with a specific activity of 6472 unit/mg protein with 10 times fold. The main goal of the present work was to test this enzyme in hydrolyzing the raw starch. Two substrates were used: corn starch and potato starch 2% (w/v). The effect of enzyme dosage and thermal processing of substrate on kinetics and efficiency of hydrolysis were studied. The results suggested that the glucoamylase activity is increased as the increase of enzyme concentration and the enzyme was sufficiently effective in hydrolyzing tested raw starch, and thermal modification of substrates was not necessary. 2009) 3( 22الهیثم للعلوم الصرفة والتطبیقیة المجلدمجلة ابن تنقیة الكلوكوامیلیز الفطري ودراسة تأثیر الجرعات المختلفة من االنزیم تحلل النشا الخام فيوالمعامالت الحراریة التصنیعیة في فعالیة االنزیم د مثلى كاظم محمد جوا د ،كلیة التربیة ابن الهیثم ،قسم الكیمیاء جامعة بغدا الخالصة ـــ Asp.nigerُنقــيَّ الكلوكـــوامیلیز المنــتج مـــن عزلــة ـات االمونیــوم، والترشـــیح بالـ ــاطة الترســیب بكبریتــ االســـود بوسـ Sephadex G 200ملغم بروتین، وبدرجة عشر مرات تنقیة/وحدة 6472فعالیة نوعیة ي، ونتج من التنقیة أنزیم ذ. اســاس يلهــذا الغـرض مـادت عملالهـدف الـرئیس للعمــل الحـالي هـو اختبــار قـدرة هـذا االنــزیم علـى تحلـل النشــا الخـام، فاسـتان ـا همـا ثـم درسـت تـأثیر الجرعـات المختلفــة لالنـزیم والمعـامالت الحراریـة التصـنیعیة فــي (v/w)% 2نشـا الـذرة، ونشـا البطاطـ وان االنـزیم كـان كفـوءًا فـي تحلـل ،النتائج ان فعالیة االنزیم تزداد بزیادة تركیـزهودلت .تحلل النشا فياالنزیم یةحركیات وكفا .وان المعامالت الحراریة للمادة االساس لیست ضروریة ،النشا الخام المقدمة بشـكل واسـع فـي الطبیعـة، فهـو موجـود فـي االنسـجة الحیوانیـة والنباتیـة Glucoamylaseیوجـد أنـزیم الكلوكـوامیلیر ـاء المجهریـة ، )2(االنــزیم االســود منتجــًا جیـدًا لهــذا Aspergillus nigerفطــر دویعــ)1 (وتنتجـه اعــداد واسـعة مــن االحیـ . )3(طویلة في انتاج الكحول من تخمر المواد النشویة عمل مدةاست -αهما ألفا أمیلیـز Asp-nigerمن فصل وتنقیة نوعین من أنزیمات االمیلیز المنتجة من فطر )4(تمكن الباحث amylase والكلوكــــوامیلیز Glucoamylase ـــرة یعمــــل االخیــــر علــــى تحطــــیم ، اذ ــر االصـ ـــالل كســ ـا مــــن خـ جزیئــــة النشـــ ـــــوع ــــ ــــة نــ ــــ ـــیدیة الخارجیـــ ــــ ــــــن (α-1,6 and 1,3-glucosidic linkage)الكالیكوســـ ــــ ـــــال عـ ــــ فضــ (α-1,4-glucosidic linkage) مـن فصـل نـواتج تحلـل النشـا بوسـاطة )6(وتمكـن الباحـث )5(یةنهائ امنتجًا الكلوكوز نتائج افلــم یجــد أثــر (HPLC) الفـائق ذي االداءكروموتــوكرافي بو (TLC)الكلوكـوامیلیز الفطــري باســتخدام كروموتـوكرافي الرقــائق والكلوكـوامیلیز مـن نـوع االنزیمـات المحبـة للحـرارة . وانمـا وجـد فقـط الكلوكـوز ،للسكریات المتعددة المتضمنة السكریات الثنائیـة .)7(مº 60 -50فهو ذو ثباتیة عالیة في الدرجات الحراریة الواقعة بین (Thermophillic)العالیة كلوكوأمیلیز فهو یعمل على االصرة الداخلیة نوع Asp.nigerاما أنزیم االلفا أمیلیز الذي ینتجه فطر الى جانب ال (α-1,4-glucose-4-glucanohydrolase) من انزیمات التسییل نوعendo-cleavage یعمل على االصرة ، اذ(α- 1,6-glucosidic linkage) الرقم االمثل .)8(الداخل ویعمل بشكل عشوائي منتجًا الدكسترینات والمالتوز والكلوكوزمن .)9(م ْ 35بدرجة ) 5-4(وللكلوكوامیلیز ) 6.2(لثباتیته ـا ـاتج مــن تخمـــر النشـ فضــال عـــنان النــزیم الكلوكــوامیلیز أهمیــة صـــناعیة كبیــرة فــي انتــاج الكلوكـــوز والكحــول النـ .)11(انه یتمیز بخلوِه من السموم الفطریةالسیما )10(الصناعات الصیدالنیة عة منتجـات النشـا اجـراء عملیــة الطـبخ لغـرض جلتنتـه بعــدها یضـاف أنـزیم االلفـا أمیلیــز لقـد جـرت العـادة فـي صــنا ان المعاملة الحراریة المستخدمة في )12(النتاج الكلوكوز ثم یضاف أنزیم الكلوكوأمیلیز) خفض اللزوجة(لتسییل النشا 2009) 3( 22مجلة ابن الهیثم للعلوم الصرفة والتطبیقیة المجلد النشـا تكلــف الصـناعة مبــالغ طائلـة، لــذلك أنصـبت جهـود البــاحثین باتجـاه أنتــاج انـزیم كلوكــوامیلیز لـه القــدرة ةجلتنـ ـام ـا الخـــ ـــل النشــ ــى تحلیـ ــاحثین ، اذ )1()غیـــر المجلــــتن(علـ ـــد مـــن البــ ــات ان )13(بـــین العدیـ هنـــاك ثالثــــة أنـــواع مــــن أنزیمــ الیمتلكـان Glaو Gluتحطیم جزیئـة النشـا الخـام واالنـزیمین االخـرین همـا له القابلیة على Glmالكلوكوامیلیز احدها یدعى .مثل تلك الصفة ة أنــزیم الكلوكـوامیلیز المنــتج مــن عزلـة ـة Asp.nigerلـذا فــان مـن أهــم اهــداف هـذا البحــث هــو تنقیـ المحلیــة ودراسـ ـا تــ ـا الـــذرة ونشـ ــي تحلــل نــوعین مـــن النشــا همــا نشـ ـامالت الح ،البطاطــاأثیر تركیــز الكلوكــوامیلیز فـ أثیر المعـ راریـــة ودراســـة تــ .جلتنم للنشا الم ْ 50ا الخام ودرجة م للنش ْ 45بدرجة التحللیةالتصنیعیة في فعالیته المواد وطرائق العمل تنقیة االنزیم االنــزیم بموجــب قیـة تمــت تن )7(االسـود Asp.nigerتـم الحصــول علیـه بشــكل مـزارع ســائلة للعزلـة المحلیــة : االـنزیم الخــام -:ةالتیالخطوات ا ولىالخطوة اال م، ْ 4دقیقـة وبدرجــة 15دورة مـدة 4000اجـراء عملیـة الطـرد المركـزي علـى المـزارع السـائلة المـذكورة آنفـًا وبمعـدل ـه فحوصــات الفعالیــة وكمیــة 200جمــع حــوالي وتـم ـا الفطــر ثـم أجریــت علیـ مللتــر مــن أنـزیم الكلوكــوأمیلیز الخــالي مــن خالیـ .بروتینال الخطوة الثانیة )14(طة كبریتـات االمونیــوماترسـیب االنـزیم بوســ وذلـك بأضــافة مـادة كبریتـات االمونیــوم الـى االنــزیم علـى اربعــة دقیقـة 15دورة مـدة 5000وفي كل مـرة تجـرى عملیـة الطـرد المركـزي بمعـدل %100و % 80، %60، %40هي مراحل ة مـع تعیـین فعالیـة 4.2منظم الفوسـفات ذو الـرقم الهیـدروجیني  0.2مع اذابة البروتین المترسب في محلول فـي كـل مرحلـ .االنزیم وكمیة البروتین الخطوة الثالثة النضج الغشائي یؤخـذ الراسـب المـذاب فـي ، اذ المـنظم ثـم فـي بلـورات سـكر المائـدةماء المقطـر والمحلـول اجراء عملیة الدیلزة مقابل ال المستحصل علیه من الخطـوة الثانیـة ویوضـع فـي انابیـب الـدیلزة مـع 4.2منظم الفوسفات ذو الرقم الهیدروجیني 0.2محلول ـم تنقـل الـى المـاء المقطـر للمـدة نفســها، ســاعات 3غلـق االنابیـب بأحكـام ووضـعها مـدة فـي مـنظم الفوسـفات المـذكور آنفـًا ثـ ة بدرجــة 3بعـدها توضـع فـي بلـورات السـكروز مــدة ة بعــد ْ 5سـاعات اخـرى ثـم تحفـظ بالثالجـ م الجـراء عملیـة التنقیـة الالحقـ .قیاس الفعالیة وكمیة البروتین الخطوة الرابعة مـن Diafloultra fiteraباسـتخدام مرشـحات Ultra filtration of crude enzyme(15) الترشـیح الفـائق PMنـوع ـة فــان هــذا النــ 10 ـتنادًا الــى تعلیمــات الشــركة المنتجـ الجزیئیــة االوزان يوع مــن المرشــحات یســمح للجزیئــات ذواسـ تـم .م ْ 4بـار وبدرجـة 2-1.5االوزان االعلى وباستخدام ضـغط ير من خاللها والیسمح للجزیئات ذاو أقل بالمرو 10.000 .مرات بعدها قیس الحجم وفعالیة االنزیم وكمیة البروتین 3تركیز االنزیم بمقدار الخطوة الخامسة بمـادة معبـا ) 2.6× 7.0(العمـود ه، اذ اسـتخدم تـم تحضـیر ، Gel filtrationالترشـیح الهالمـي اسـتخدمت طریقـة (Sephadex G200) واضیفت المادة 4.2الرقم الهیدروجیني يذ المحلول منظم الفوسفات و استعمل ، 2009) 3( 22مجلة ابن الهیثم للعلوم الصرفة والتطبیقیة المجلد Sodium azide مـل مــن عینـة االنــزیم 1لمنــع نمـو الفطریـات داخــل حشـوة العمــود وأضـیف )% 0.02(بتركیـز سـاعة /مـل 40ر بسـرعة فـالجـل وبموجـب جریـان الب التي حصلنا علیها من الخطوة الرابعة بعنایة الـى قمـة العمـود فـوق سـطح روتین وتمـت قـراءة االمتصـاص الضــوئي وتـم تعیـین فعالیـة االجـزاء وكمیـة البـ. مـل لكـل جـزء 5جـزء بواقـع 50جمـع خاللهـا مـن نـوع االنـزیم الفطـري ثبـتزیم الكلوكـوأمیلیز القیاسـي للتوكـررت العملیـة مـع انـ ،نـانومیتر 280 لكل جزء على طول موجي .قید البحث عملالمست التحلیالت الكیمیائیة )17: (تقدیر البروتین )18(: یة االنزیمقیاس فعالو ) 19: (تقدیر كمیة الكلوكوزو )19(: تعیین كمیة الدكستروز المكافيءو Specific activityالفعالیة النوعیة تقدیرو :وتحسب بموجب المعادلة ملغم بروتین/ وحدة= = الفعالیة النوعیة تعیین تركیز حامض االوكزالیك مـن وجـود حــامض االوكزالیـك الـذي قـد ینـتج مــن ثبـتوهـي طریقــة كیمیائیـة للت )16(ي اتبعـت الطریقـة المـذكورة فـ .بعض الفطریات فحص السمیة فـي االنـزیم الخـام وأهمهـا سـموم فربة السـموم الفطریـة التـي قـد تتـوالقیـاس نسـ) 11(استخدمت الطریقة المـذكورة فـي ، B1وتـم تحضـیر محالیـل قیاسـیة مـن سـموم االفالتوكسـین وهـي (HPLC) السمیة بوسـاطة جهـاز اذ قسیت ،االفالتوكسین B2 ،G1 ،G2 من شركة(Sigma, st.louis- M o, U.S.A) ایكرو 10، 0.1، 0.01، 0.001بتركیـز علـى مـل/غراممـ ثـم حقنـت المحالیـل القیاسـیة فـي الجهــاز 1: 9بنسـبة Acetonitrileنتریـل الخلیــك و فـي محلـول مكـون مـن البنـزین التـوالي .مایكرولیتر مع كاشف فلورسیني 40بكمیة ).خام(غیر المعاملة حراریًا (v/w)% 2 میلیز في تحلل نشا الذرة والبطاطادراسة تأثیر تركیز الكلوكوا A- 2 وسط نشا الذرة بتركیز %(v/w) م ْ 40وبدرجـة حـرارة 4.2 يهیـدروجینالالـرقم المذاب في منظم الفوسفات ذي 90وحضــنت مـــدة ) مــل/ملغــم بـــروتین 0.120و 0.0600، 0.0300، 0.0150، 0.0075(اضــیفت التراكیــز .دقائق 10الكلوكوامیلیز كل یةالمتحررة وكفا تقاس كمیة الكلوكوز )19(م ْ 40 دقیقة في حمام مائي بدرجة B- ا بتركیـز م ْ 40وبدرجــة 4.2الـرقم الهیـدروجیني المـذاب فــي مـنظم الفوسـفات ذي (v/w)% 2وسـط نشـا البطاطـ ة تقـ 90م مـدة ْ 40من االنزیم وحضنت في حمـام مـائي بدرجـة Aفي نفسها اضیفت المقادیر المذكورة اس دقیقـ .دقائق 10ل االنزیم ك یةكمیة الكلوكوز المتحررة وكفا مل/فعالیة االنزیم وحدة مل/كمیة البروتین ملغم 2009) 3( 22مجلة ابن الهیثم للعلوم الصرفة والتطبیقیة المجلد TLCتشخیص الكلوكوامیلیز بوساطة زیمــي فصــلت نــواتج التفاعــل االن اذ )20(ســتخدمت الطریقــة المــذكورة فــي ا (TLC)فصـل نــواتج التفاعــل بطریقــة .وتمت المقارنة مع الكلوكوامیلیز القیاسي (TLC) قبطریقة كروموتوكرافي الرقائ الفعل التحللي لالنزیم فيتأثیر المعاملة الحراریة التصنیعیة A- ـا الـذرة /ملغـم بــروتین 0.0600اضـیف الكلوكـوامیلیز بتركیــز ـا (v/w)% 2مـل الــى وسـط نشـ ووســط نشـا البطاطـ 2 %(v/w) اس كمیـة الكلوكــوز تقـ. دقیقـة قبـل الوصـول الـى حالــة الجلتنـة 90م مــدة ْ 45بعـد رفـع حرارتهـا الـى .دقائق 10االنزیم كل یةالمتحررة وكفا B- ا بتركیــز م ْ 50مــل وهـي بدرجــة /ملغـم بـروتین 0.006یضـاف الكلوكـوامیلیز الــى وسـطي نشـا الــذرة ونشـا البطاطـ ام مـائي علـى ـة 90م مـدة ْ 50حــرارة وبحالـة جلتنـة وتتــرك فـي حمــ یــةاس كمیـة الكلوكــوز المتحـررة وكفاتقـ. دقیقـ .دقائق 10االنزیم كل النتائج والمناقشة تنقیة االنزیم الخام ـام المنــتج مــن عزلـــة عملاســت )7(المحلیــة بشــكل مــزارع ســائلة للفطـــر االســود Asp.nigelأنــزیم الكلوكــوامیلیز الخـ Jabor et al, (2004). اجریت عملیة الترشیح للحصول على االنـزیم الخـام الخـالي مـن خالیـا الفطـر ثـم رسـب بكبریتـات االمونیـوم واجریـت .Sephadex G 200بعدها عملیة الدیلزة وتنقیة االنزیم بوساطة الترشیح الهالمي باستخدام ارتفعـت الفعالیـة النوعیـة اذ ،بعد كـل خطـوة تنقیـة على ان الفعالیة النوعیة لالنزیم تزداد) 1(النتیجة المبینة بالجدول رقم دلت .مرة اكثر من الخطوة التي تسبقها 5.7ملغم بروتین بمعدل تنقیة /وحدة 3670.5بعد الترسیب بكبریتات االمونیوم الى لغــم م/وحـدة 4023.6وعنـد اجـراء عملیــة الـدیلزة لالنـزیم مقابــل بلـورات السـكروز ادت الــى رفـع الفعالیـة النوعیــة الـى الى زیادة الفعالیـة النوعیـة Sephadex G 200مرة تنقیة كما ادت خطوة الترشیح الهالمي بوساطة 6.2بروتین بما یعادل مرات تنقیـة عـن الخطـوة االولـى لقـد دلـت هـذه النتـائج علـى ان الزیـادة 10بما یعادل ملغم بروتین /وحدة 6471.6لالنزیم الى ،منهـا عدیـدة وسـائل التنقیـة علـى عوامـل ، تعتمـد)15، 6(النوعیـة تـهفعالیة في تركیـزه ورفـع في تنقیة االنزیم تؤدي الى زیاد ومیـل االنـزیم ،ثباتیتهوالرقم الهیدروجیني االمثل ل ،ونقطة التعادل الكهربائي ،وصافي شحنة البروتین ،حجم جزیئات البروتین ـا )21(لالرتبــاط بـــبعض المـــواد فقـــد توصــل الباحـــث ــز المنـــتج مــن بكتریــ ة انــزیم االلفـــا امیلیـ Lactobacillusالـــى تنقیـــ fermentum مــرة اكثــر مــن الخطــوة االولــى عنــدما اســتخدم طریقــة الترســیب بــالكالیكوجین واســتخدم 28الـى تنقیــة تعــادل .بادل االیونيكروماتوكرافي الت ـة فــي الشـكل ن بــروتین ظهــر مـع االجــزاء الخارجــة مــن وجــود اكثــر مـ (a) 1دلـت نتیجــة الترشــیح الهالمـي المبینـ . 24-18العمود وعند قیاس فعالیة الكلوكوامیلیز وجد انها واقعة بین االنابیب ـة نمــوذج القیاســـي للكلوكــوامیلیز بعــد امـــراره علــى الهـــالم الــذي یمثـــل اال (b) 1بالشـــكل رقــم (a) 1الشـــكل رقــم وعنــد مقارنـ Sephadex G 200 ـد ضــبط وقـــت االضــافة نفســها وجــد ان االنــزیم یقــع فـــي االنابیــب وهــذا دلیــل علــى ان عزلـــة ،عنـ Asp.niger ة هـي منتجـة لــون اذ اللكلوكـوامیلیز، وان جـزء البـروتین االخـر المنفصـل اختبـر باضـافة الیـود فكـون معقـد المحلیـ لالمیلـوبكتین منتجـًا سالســل االمیلـوز القصـیرة التــي ازرق داللـة علـى ان االنـزیم یعمــل علـى االواصـر الكالیكوســیدیة الفرعیـة ـة تنــتج انــزیم االیزوامیلیــز الــى جانـــب االســود Asp.nigerأي ان عزلــة ، ) 22،15(اللــون االزرق مــع الیــود تعطــي المحلیـ .الكلوكوامیلیز 2009) 3( 22مجلة ابن الهیثم للعلوم الصرفة والتطبیقیة المجلد TLCفصل نواتج تفاعل االنزیم بوساطة ة فـي ). TLC )20مـن تشـخیص االنـزیم فصـلت نـواتج التفاعـل االنزیمـي بطریقـة ثبتلزیادة الت دلـت النتـائج المبینـ ه مـع محلـول الكلوكــوز القیاسـي وهـذا دلیـل علــى وجـود انـزیم الكلوكـوامیلیز الــذي ) 2(الشـكل رقـم تكـون سـكر الكلوكــوز وتحركـ ونالحـظ بقـاء بعـض السـكریات علـى خـط البدایـة وهــذا )22، 20، 15( بشـكل كامـل الـى كلوكـوز كنـاتج نهــائيیحطـم النشـا .یعود الى ارتفاع الوزن الجزئي لهذه السكریات مما سبب عدم تحركها مع محلول الفصل قیاس السمیة ة بطریقــة HPLCتـم التحــري عــن سـموم االفالتوكســین وحــامض االوكزالیـك فــي المســتخلص االنزیمـي قیــد الدراســ .السموم الفطریة وحامض االوكزالیك أظهرت النتائج خلوه من اذبالمقارنة مع السموم القیاسیة، Bونشا البطاطا Aشا الذرة تحلل النشا في وسطین مختلفین للنشا هما ن فيتأثیر تركیز الكلوكوامیلیز النقي :مختلفة هي عدیدة تخافیفبأضیف الكلوكوامیلیز النقي Bونشا البطاطا Aفي وسطین للنشا هما نشا الذرة ) مل/ملغم بروتین 0.120، 0.0600، 0.0300، 0.0150، 0.0075( تقـاس كمیـة الكلوكـوز .دقیقـة 90م مـدة ْ 40وحضنت االوساط فـي حمـام مـائي بدرجـة ،لكال الوسطین (v/w)% 2بتركیز بـأن سـرعة تحلـل النشـا (b) 3والشـكل رقـم (a) 3دقائق، دلت النتائج المبینة في الشكل رقم 10االنزیم كل یةالمتحرر وكفا تركیــز تـزداد بزیـادة % DEكسـتروز دالمئویـة للاالنـزیم المعبـر عنهـا بالنســبة یـةا بكمیـة الكلوكـوز المتحــررة وكفاالمعبـر عنهـ ه كانـت عنـد الدقیقـة االنـزیم ، وان انـزیم الكلوكـوامیلیز مـن فتـرة الحقـن لكافـة التراكیـز المسـتخدمة 50وان اقصـى سـرعة تحلـل لـ ، 19( یـةبتراكیـز عال عمالهمتعـددة بتقاعـل عكسـي عنـد اسـت یؤدي الى تفاعل بلمرة للكلوكوز أي یحول الكلوكوز الى سـكریات .Bو Aمل في الوسطین /ملغم 0.0600للكلوكوامیلیز كانت عند التركیز یةلذا فان افضل كفا) 24، 23 فیمـا كـان ،ً كـان سـلوكًا منتظمـًا وواضـحا Aفـي الوسـط ان سـلوك االنـزیم (b)و (a) 3كما دلت النتائج المبینة بالشـكل رقـم ا تـأثیرًا Bفي تحلل الوسط سلوكه عشوائیاً ة بالمـادة االسـاس التـي لهـ وهـذا یعتمـد علـى شـكل ونـوع وحجـم جزیئـة النشـا الخاصـ ).23-21، 19(سلوك وتفاعل االنزیم فيواضحًا النشـا الخـام االسـود المحلیـة فـي تحـلل Asp.nigerتج مـن عزلـة نـقابلیـة الكلوـكوامیلیز الم فـيتأثیر المعامالت الحراریة . والمجلتن ـة Bو Aمــل الـى الوسـط /ملغـم بـروتین 0.0600فـي هـذه التجربــة أضـیف االنـزیم بتركیــز ـام ْ 45بدرجـ م للنشـا الخـ ، 22، 19،20، 2،3(النشـا وهي الدرجات الحراریة المسـتخدمة فـي العملیـات التصـنیعیة لمنتجـاتم للنشا المجلتن ْ 50ودرجة .عالیةثباتیة حراریة يیتطلب فیها استخدام انزیم ذ التي) 24 الكلوكــوامیلیز یـةلحراریــة لـم تــؤثر فـي فاعلیــة وكفاان المعاملـة ا (b)و (a) 4دلـت النتــائج المبینـة فــي الشـكل رقــم ة تصـل الـى النتحت ظروف هذه التجربة Asp.nigerالمنتج من العزلة المحلیة و انم ْ 70االنزیم ذو ثباتیة حراریـة عالیـ ).25(من نوع المحب لدرجات الحرارة العالیة عملالفطر المست امـا .فـي تحلـل النشـا یتهشاط التحللي لالنزیم ودرجة كفاوتطابقًا في الن تشابهاً (a) 4اظهرت النتائج في الشكل رقم م و فـي الحـالتین النشـا الخـا tلتوزیـع 0.05لیست ذي فارق معنوي عنـد مسـتوى فكانت (b) 4النتائج المبینة في الشكل رقم ة طـبخ النشـا فـي العملیـات التصـنیعیة المجلـتن لوسـط نشـا البطاطـا االنـزیم ذو قـدرة النومـن الممكـن ان االسـتغناء عـن عملیـ ـة جیــدة یتكــون مــن أنـــواع االســود Asp.nigerانــزیم الكلوكــوامیلیز المنــتج مــن العزلــة انللنشــا الخــام وهــذا یــدل علــى تحلیلیـ مختلفة من الكلوكوامیلیز تختلف في شكل الموقع الفعال والوزن الجزیئي ولها القدرة على التغلغل الى داخل عدیدة 2009) 3( 22مجلة ابن الهیثم للعلوم الصرفة والتطبیقیة المجلد ـا لتحطـیم االواصـر الداخلیــة التـي اقتصــر تحطیمهـا علـى انــزیم ا اذ، )25، 20، 9(اللفـا أمیلیــزكتلـة البـولیمر فــي جزیئـة النشـ نـه یعمــل علـى االواصـر الداخلیــة لتمهیـد العمـل النــزیم الالنشـا اعتمـدت الصـناعات علـى االلفــا امیلیـز فـي تحطــیم بـولیمرات ).22، 20، 15(انهائی االكلوكوامیلیز الذي یحطم االواصر الخارجیة للسكریات المتعددة ویحولها الى الكلوكوز ناتج المصادر 1. Horvathova, V.; Janecek, S. and Sturdik, E., (2000).Amylolytic enzmes :theirspecificties,origins and roperties,Biologia, Bratislava. 55: 603-613. 2. Ueda, S. and Koba, Y., (1981). Amylolytic system of blak-koji mold, Biotech.Bioeng,. 23: 291. 3. Park, Y.K., (1982). J of Biotech. Bioeng., 24: 495. 4. Abouzeid, A.M ., (1997). 89 (358): 55-66.. 5. Chessa, J. P.; Feller G. and Gerday, C., (1999). TAC 240B- can. J. Microbiol., 45: 452- 457. 6. Pandey, A.; Nigam, P.; Soccol C.; Singh D. and Mohan, R., (2000). Biotechnol. Appli. Biochem., (31): 135-152. 7. Jabor, S.; Jawad, M. and Mahammad, J. S., (2004). J. of P. Applied sciences, 17(2): 10- 18. 8. Dlaly, B.K. and Mahmood, W.A., (1985). zanco.. 3(2): 47-58. . 9. El-Safey, E.M. and Ammar, M.S., (2004). Univ. Bull. Environ.. 7(1): 93-99. 10. Octavio, L.F.; Daniel, J. R. and Francislete, R.M., (2000). Eur. J. Biochem. 267: 2166- 2173. 11. Alani, H.H.; Soyood, R.; Zainab, M. and Abdl-Kharim, A., (1994). unpublished j. of applied sciences 6(1): 22-32. 12. Gasperik, J.; Hostinova, E.; Minarikova,O.; Soldaneva, I. and Zelinka, J., (1988). Biologia, Bratislava, 43: 673-679. 13. Hostinova, E.; Solovicova A.; Dvorsky, R. and Gasperik, J., (2003). Arch. Biochem. Biophys. 411: 189-195. 14. Dixon, M. and Webb, E.G., (1964). Enzymes, 2 nd Edit. Academic press. Inc. New York. 15. Simone, C.; Peixoto. Joao, A. and Jorge. Hecto, F., (2003). Int. Microbiol, 6: 269-273. 16. Hadwan, H. A., (1987). Ph.D. thesis Division Mycology and plant pathology. India Agri. Research Institute, New Delhi. 17. Chykin, S., (1966). Biochemistry laboratory . Techniques John wiley and Sons. New York, London, Sydney. 18. Somogy, M. Noles, (1952). J. Biol. Chem. 195: 19-22. 19. Horvathova, V.; Slajsova, K. and Ernest, S., (2004). Biologia, Bratislava, 59(3): 361-365. 20. Chaplin, M.F., (1986). Monosaccharides in carbohydrate analysis, Ed. By M.F. Vhaplin and J.F. Kennedy. IR1. Press Limited. England. 21. Tanlamond, P.; Desseaus, V.; Morean, Y.; Santimone M. and Marseille G., (2002). Comp Biochem physiol. B Biochem Mol. Biol. 133(3): 351-360. 22. James,J.A. and Lee, B.H, (1997). J. food. Biochem 21: 1-52. 23. Abdel-Rahman, E. M., (1990). Ph.D. thesis, Al-Azhar Univ., Fac. Of Sci., Bot. and Microbial. Dept., Cairo, Egypt. 24. El-Safey, E.M, (1994). Sci. A thesis, Bot. and Microbial. Dept., Fac. Sci., Al-Azhar Univ., Cairo, Egypt. 25. Odibo, F.J.C. and Ulbrich- Hofmann, R., (2001). Acta Biotechnological, 21(2):141-153. 2009) 3( 22مجلة ابن الهیثم للعلوم الصرفة والتطبیقیة المجلد .االسود Aspergillus nigerتنقیة انزیم الكلوكوامیلیز المنتج من عزلة ): 1(جدول طریقة التنقیة حجم االنزیم ml فعالیة االنزیم u/ml كمیة البروتین mg/ml الفعالیة الكلیة u/ml البروتین الكلي u/ml الفعالیة النوعیة u/mg prot عدد مرات التنقیة الكلوكوامیلیز الخام )راشح المزرعة( 200 266.1 0.42 53220 84 633 1 كبریتات االمونیوم %)60اشباع درجة ( 200 660.7 0.18 132140 36 3670.5 5.7 زة مقابل الدیل السكروز البلوري 15 2213.1 0.55 33196 8.25 4023.6 6.2 Sephadex G200 chromatography )الترشیح الهالمي( 5 3236 0.5 16180 2.5 6472 10 G scphadex 200 عمالبالترشیح الهالمي باست A. nigerلیزالمنتج من میتنقیة انزیم الكوكوا )a 1( مقكل ر ش 40المنفصل وبسرعة جریان مل للجزء 5وبواقع 4.2رقم الهیدروجیني ال ذي M 0.1ومحلول منظم الفوسفات ساعة/مل 2009) 3( 22مجلة ابن الهیثم للعلوم الصرفة والتطبیقیة المجلد ومحلول منظم G Sephadex 200 عماللیز القیاسي باستیالهالمي النزیم الكلوكوامالترشیح : )1b(شكل .ساعة/مل 40مل للجزء المنفصل وبسرعة جریان 5وبواقع 4.2رقم الهیدروجیني ال ذي M 0.1الفوسفات TLCلیز بطریقة یفصل نواتج تفاعل انزیم الكلوكوام )2(شكل 2009) 3( 22مجلة ابن الهیثم للعلوم الصرفة والتطبیقیة المجلد ) pH )4.2في 2A %(v/w)تأثیر تركیز الكلوكوامیلیز في تحلل نشا الذرة الخام : (a3)شكل .م ْ 40ودرجة م ْ 40ودرجة ) 4.2( pHفي 2B %(v/w)الخام لبطاطاتأثیر تركیز الكلوكوامیلیز في تحلل نشا ا: b) 3(شكل 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 ١٠ ٢٠ ٣٠ ٤٠ ٥٠ ٦٠ ٧٠ ٨٠ ٩٠ ٠.٠٠٧٥ ٠.٠١٥ ٠.٠٣ ٠.٠٦ ٠.١٢ )دقیقة(الوقت 0 5 10 15 20 25 ١٠ ٢٠ ٣٠ ٤٠ ٥٠ ٦٠ ٧٠ ٨٠ ٩٠ ٠.٠٠٧٥ ٠.٠١٥ ٠.٠٣ ٠.٠٦ ٠.١٢ )دقیقة(الوقت غم مل ز كو لو لك ا یة كم / ل م غم مل ز كو لو لك ا یة كم / ل م 2009) 3( 22مجلة ابن الهیثم للعلوم الصرفة والتطبیقیة المجلد م ْ 45وبدرجة حرارة pH 4.2و (v/w) %2تأثیر المعاملة الحراریة في عمل الكلوكوامیلیز في نشا الذرة : (a4)شكل للنشا المجلتن م ْ 50للنشا الخام ودرجة وبدرجة حرارة pH 4.2و (v/w)% 2لكلوكوامیلیز في نشا البطاطاتأثیر المعاملة الحراریة في عمل ا: (b4)شكل للنشا المجلتن م 50ْم للنشا الخام ودرجة 45ْ 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 ١٠ ٢٠ ٣٠ ٤٠ ٥٠ ٦٠ ٧٠ ٨٠ ٩٠ نشا مجلتن نشا خام )دقیقة(الوقت غم مل ز كو لو لك ا یة كم / ل م 0 5 10 15 20 25 30 ١٠ ٢٠ ٣٠ ٤٠ ٥٠ ٦٠ ٧٠ ٨٠ ٩٠ نشا مجلتن نشا خام )دقیقة(الوقت غم مل ز كو لو لك ا یة كم / ل م