Exosomes and Microvesicles 
 
 
 
 
Ovarian Cancer-Derived Exosomal 
Fibronectin Induces Pro-Inflammatory IL-1 
 
Original Research Article 
 
 
 

Safinur Atay1, Carolyn D. Roberson2, Cicek Gercel-Taylor3 and Douglas D. Taylor3,* 
 
1 Department of Pathology & Laboratory Medicine, University of Kansas Medical Center, Kansas City, KS, USA 
2 Department of Microbiology & Immunology, University of Louisville School of Medicine, Louisville, KY, USA 
3 Department of Obstetrics, Gynecology & Women’s Health, University of Louisville School of Medicine, Louisville, KY, USA 
* Corresponding author E-mail: ddtaylor@louisville.edu 
 
Accepted 19 Feb 2013 
 
© 2013 Atay et al.; licensee InTech. This is an open access article distributed under the terms of the Creative 
Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/3.0), which permits unrestricted use, 
distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. 

 
 
Abstract  The  tumour  microenvironment  is 
characterized by pro‐inflammatory profiles,  including 
interleukin‐1  (IL‐1β).  This  profile  is  generated  by 
infiltrating  macrophages  following  interactions  with 
tumours  or  their  components.  The  objectives  of  this 
study  were  to  identify  whether  tumour  exosomes 
could  induce  macrophage  IL‐1β  production  and  the 
mechanism  involved.  Exosomes  were  isolated  from 
ovarian  cancer  patients  and  ovarian  tumour  cells  by 
chromatography  and  ultracentrifugation.  Specific 
exosomal proteins were defined by mass spectrometry 
(MS)  and  confirmed  by  Western  immunoblotting. 
Using macrophage‐like THP‐1 cells, induction of IL‐1β 
release was investigated by ELISA. RGD peptides were 
used  to  block  fibronectin  binding  by  THP‐1  51 
integrin.  Exosomes  isolated  from  ovarian  cancer 
patients  and  from  ovarian  cancer  cells  were 
demonstrated, by MS and immunoblotting, to express 
fibronectin.  Incubation  of  THP‐1  cells  with  these 
exosomes  induced  pro‐inflammatory  cytokines,  in 
particular  IL‐1β.  Blocking  of  THP‐1  binding  of 
exosomal  fibronectin  with  RGD  peptides  abrogated 
exosome‐mediated IL‐1β production and down‐stream 
phosphorylation  of  Akt  and  c‐Jun.  Although  cancer 
patients generally exhibit increased levels of IL‐1β, the 

underlying  mechanism  is  unclear.  Here,  tumour‐
derived  exosomes  are  demonstrated  to  induce  pro‐
inflammatory  cytokine  in  macrophages  including  IL‐
1, whose induction is mediated by fibronectin. 
 
Keywords Exosomes, Fibronectin, IL‐1, Macrophages 

                                         
1. Introduction 
 
Macrophages have been  implicated  in phagocytosis and 
tissue  remodelling  and  production  of  cytokines  and 
chemokines  [1,  2].  Unlike  many  cells  of  the  innate 
immune  system,  macrophages  exhibit  a  high  degree  of 
plasticity and can differentiate depending on the signals 
in  their  environment  [3].  Based  on  their  receptors  and 
cytokine production, macrophages can be defined as M1 
or M2 macrophages. Pro‐inflammatory M1, or classically 
activated,  macrophages  exhibit  up‐regulation  of  pro‐
inflammatory cytokines and chemokines, including TNF‐
α, IL‐12, IL‐6, CCL2 and IL‐1β,  in addition to  increased 
production  of  reactive  oxygen  species  and  nitrogen 
intermediates  [4].  In  contrast,  anti‐inflammatory  M2,  or 
alternatively  activated,  macrophages  are  polarized  by 
stimuli  such  as  IL‐4,  IL‐13,  IL‐10  or  glucocorticoid 

1Safinur Atay, Carolyn D. Roberson, Cicek Gercel-Taylor and Douglas D. Taylor: 
Ovarian Cancer-derived Exosomal Fibronectin Induces Pro-inflammatory IL-1ß

www.intechopen.com

ARTICLE

www.intechopen.com Exosomes microvesicles, Vol. 1, 2:2013



hormones  [4]  and  up‐regulate  scavenger,  mannose  and 
galactose  receptors.  They  are  IL‐1  receptor  antagonists 
and  downregulate  IL‐1β  and  other  pro‐inflammatory 
cytokines [5].  
 
The malignant behaviours of tumour cells are defined by 
the microenvironment, where macrophages represent the 
major  population  of  immunologic  cells  inltrating  the 
tumours. These  infiltrating macrophages are referred  to 
as  tumour‐associated  macrophages  (TAMs).  While 
initially it was believed that these macrophages exhibited 
anti‐tumour  activity,  the  inltration  of  TAM  into 
tumours,  such  as  breast,  ovarian,  prostate  and  cervical 
cancers,  has  been  correlated  with  poor  prognosis  and 
short survival [6]. This adverse function of macrophages 
has  been  attributed  to  their  immunosuppressive  nature 
[7].  Recent  studies  have  demonstrated  that  TAMs 
promote  tumour  cell  proliferation,  invasion  and 
metastasis, as well as angiogenesis, which is essential for 
tumour growth [8]. TAMs secrete a variety of cytokines, 
growth  factors  and  enzymes,  which  promote  tumour 
metastasis and angiogenesis, such as vascular endothelial 
growth  factor,  IL‐8,  epidermal  growth  factor,  platelet‐
derived  growth  factor,  tumour  necrosis  factor  (TNF)‐α 
and matrix metalloproteinases [9, 10]. 
 
Cytokines  coordinate  the  immune  response  and  are 
released  in  response  to  infection,  injury,  stress  or 
trauma.  Cytokines  regulate  differentiation  and 
activation  of  various  immune  cells  and  coordinate 
inflammatory reactions, such as the induction of acute‐
phase  proteins.  The  hyper‐activation  of  pro‐
inflammatory cytokines and/or the impairment of anti‐
inflammatory  cytokines  can  lead  to  pathological 
conditions,  such  as  allergic  reactions,  sepsis  and 
dysplasia.  IL‐1,  TNF‐α  and  IL‐17  are  prominent  pro‐
inflammatory  cytokines,  whereas  IL‐10  and  TGF‐β  are 
characterized by anti‐inflammatory properties. The pro‐
inflammatory phase is characterized by the production 
of pro‐inflammatory cytokines, including interleukin 1 
(IL‐1)  [11].  IL‐1  is  a  potent  multifunctional  pro‐
inflammatory  cytokine  produced  by  monocytes  and 
tissue  macrophages.  IL‐1  promotes  multiple  events, 
such  as  attraction  and  activation  of  immune  cells, 
stimulation  of  endothelial  cell  adhesion  molecule 
expression,  and  enhanced  expression  of  extracellular 
matrices and matrix‐degrading enzymes.  
 
Our  previous  work  has  demonstrated  that  exosomes 
derived  from  a  first  trimester  extravillous  trophoblast 
were  capable  of  inducing  the  migration  of  monocytes 
and  “educating”  these  cells  to  produce  a  pro‐
inflammatory cytokine profile, including IL‐1 [12]. IL‐
1  induction  by  exosomes  was  mediated  by  a  ligand‐
receptor  interaction  and  was  shown  not  to  require 
exosome  uptake.  Other  studies  have  shown  that 

interactions  between  components  of  the  extracellular 
matrix and macrophages lead to the production in pro‐
inflammatory cytokines [13]. Proteins shown to  induce 
pro‐inflammatory  cytokines  by  macrophages  include 
Thy‐1,  vitronectin,  integrins,  thrombospondin,  myosin 
and  fibronectin.  Fibronectin  is  present  in  the 
extracellular matrix of  most  tissues,  where  it  supports 
basic  cellular  processes  including  cell  adhesion, 
migration,  survival  and  growth.  Fibronectin  is  a 
modular  protein  composed  of  independently  folded 
domains (types I, II and III), which represent regions of 
amino  acid  sequence  homology  [14].  Within  the 
extracellular matrix, fibronectin is polymerized and can 
be  subjected  to  tensional  forces  generated  by  the  cells 
that  expose  cryptic  activities  within  the  molecule, 
including binding sites for integrins and growth factors 
[15].  In  general,  fibronectins  are  a  class  of  large 
glycoproteins  with  known  adhesive  activity  for 
collagen,  fibrin,  heparin  and  cell  surfaces  and  are 
associated with wound healing, platelet aggregation and 
clotting, and cancer metastasis [16]. A specific function 
in cancer biology has not been defined for fibronectin, 
due  primarily  to  its  ubiquitous  expression  in  adult 
human tissues and plasma. Matsuura et al. identified a 
group  of  fibronectin  isoforms,  containing an  O‐linked, 
N‐acetyl‐galactosaminylated  hexapeptide  within  the 
alternatively  spliced  type  III  connecting  segment 
[17]. These  unique  fibronectin  iosforms  have  been 
identified  within  several  human  tumours  and 
developmental tissues. These isoforms are designated as 
oncofetal fibronectin and they appear to be distinct from 
plasma and cellular fibronectins based on molecular size 
and glycosylation patterns [18].  
 
In the present study, we demonstrate the induction of IL‐
1  by  cancer‐derived  exosomes  and  investigate  the 
mechanism  underlying  this  induction.  The  study 
addressed the expression of exosomal components linked 
with  the  induction  of  pro‐inflammatory  cytokines  by 
macrophages. Based  on MS  identification of  fibronectin 
on tumour‐derived exosomes, the study investigated the 
blockage  of  the  exosome‐mediated  events  by  RGD 
analogues and the molecular mechanism linked with the 
exosome‐associated  component(s)  responsible  for  the 
induction of IL‐1. 
 
2. Materials and Methods  
 
2.1 Cell culture conditions 
 
The UL‐O cell line was established from the ascites of a 
patient with Stage III papillary serous adenocarcinoma of 
the  ovary.  UL‐O  cells  were  maintained  in  75cm2  tissue 
culture  flasks  in  20ml  Hyclone  Roswell  Park  Memorial 
Institute  (RPMI)  1640  culture  media  (ThermoScientific) 
supplemented  with  2mM  L‐glutamine,  10%  exosome‐

2 Exosomes microvesicles, Vol. 1, 2:2013 www.intechopen.com



depleted  foetal  bovine  serum  (FBS),  1mM  sodium 
pyruvate,  0.1mM  nonessential  amino  acids  and 
100units/mL  penicillin‐streptomycin  in  a  humidified 
incubator at 37C with 5% CO2. FBS‐associated exosomes 
were  removed  by  ultracentrifugation  for  15  hours  at 
100,000xg. The resulting supernatant was sterile  filtered 
using a 0.22μm filter. THP‐1 acute monocytic leukaemia 
cells  were  obtained  from  ATCC  (Rockville,  MD,  USA) 
and were maintained  in RPMI 1640 supplemented with 
2mM  L‐glutamine,  10%  FBS,  1mM  sodium  pyruvate, 
0.1mM  non‐essential  amino  acids,  0.05mM  2‐
mercaptoethanol and 100 units/mL penicillin‐streptomycin 
in a humidified incubator at 37C with 5% CO2.   
 
2.2 Exosome isolation from culture media and patient ascites 
 
To  isolate  tumour  exosomes  from  culture  media,  UL‐O 
cells were utilized. UL‐O cells were cultured for three to 
four days (approximately 85% confluent and greater than 
95%  viability  based  on  trypan  blue  exclusion).  The 
conditioned  medium  was  centrifuged  at  400xg  for  ten 
minutes to remove whole cells and this supernatant was 
then  centrifuged  at  15,000xg  for  20  minutes  to  remove 
large microvesicles and apoptotic vesicles. The resulting 
cell  free  medium  was  concentrated  by  ultrafiltration 
using an Amicon stirred cell Model 8200 with a molecular 
weight cut‐off membrane of 500,000 Daltons  (Millipore, 
Billerica,  MA).  This  concentrated  material  was  then 
chromatographically  separated  using  a  Sepharose  2B 
column  (2.5x30cm).  The  void  volume  fractions  were 
pooled and centrifuged using a Ti90 rotor (Beckman) at 
100,000  x  g  for  one  hour  at  4°C.  The  pellet  was 
resuspended  in  PBS  and  the  vesicular  protein 
concentration  determined  using  the  DC  protein  assay 
(Bio‐Rad  Laboratories,  Hercules,  CA)  according  to 
manufacturer’s  instructions.  This  vesicle  preparation 
from UL‐O cells was termed OEX. 
 
To isolate exosomes from patient ascites, the ascites fluids 
were centrifuged at 400xg for ten minutes to remove cells 
and  the supernatant was centrifuged at 15,000xg  for 20 
minutes to remove cell debris and apoptotic vesicles. The 
resulting supernatant was concentrated by ultrafiltration 
using an Amicon stirred cell with a molecular weight cut‐
off  membrane  of  500,000  Daltons  (Millipore).  This 
concentrated  material  was  then  chromatographically 
separated using a Sepharose 2B column (2.5x30cm). The 
void  volume  fractions  were  pooled  and  centrifuged  at 
100,000  x  g  for  one  hour  at  4°C.  The  pellet  was 
resuspended  in  PBS  and  the  protein  concentration 
determined using  the DC protein assay. To exclude  the 
possibility  of  endotoxin  contamination  in  the  exosome 
preparations  for  both  the  culture  and  ascites‐derived 
vesicles,  a  LAL  assay  (Genscript,  Piscataway,  NJ)  was 
performed  to  quantify  any  endotoxin  in  the  vesicle 
preparations. For the exosome preparations used in these 

studies,  endotoxin  concentrations  were  <0.2EU/ml, 
including insufficient levels of endotoxin for the observed 
activation effects. Additionally, OEXs were demonstrated 
to  be  negative  for  IL‐1  mRNA  using  specific  primers 
(SABiosciences)  and  protein  using  a  commercially 
available IL1‐β ELISA kit (e‐Biosciences, San Diego, CA, 
USA). 

 
2.3 SDS‐PAGE and Western immunoblot analysis of cell 
culture lysate and culture and ascites‐derived exosomes 
 
Vesicle‐derived  proteins  or  proteins  from  total  cellular 
lysates  (30μg  each)  were  resuspended  in  a  Laemmli 
sample  buffer.  This  suspension  was  boiled  and  loaded 
onto  10%  SDS‐PAGE  gels.  After  electrophoretic 
separation,  the  gels  were  stained  with  Imperial  Purple 
Protein Stain (Pierce Chemical Co, Rockland, IL) at room 
temperature  for  two  hours  and  destained  overnight  in 
double  distilled  water.  The protein  bands were  imaged 
using  a  PharosFx  Molecular  Imager  and  Quantity  One 
Software (BioRad Laboratories, Hercules, CA).  
 
For  Western  immunoblot  analysis  [19],  10%  SDS‐PAGE 
gels were electrophoretically transferred to nitrocellulose 
membranes (BioRad Laboratories) for one hour, followed 
by  blocking  with  5%  non‐fat  milk  in  TBS  with  0.05% 
Tween  20  (TBST)  for  one  hour.  Membranes  were 
incubated  overnight  at  4C  with  the  following  primary 
antibodies:  anti‐fibronectin  (FN‐clone  TV‐1),  anti‐CD63 
(clone  Y‐18)  and  anti‐‐actin  (clone  C‐4)  (Santa  Cruz 
Biotechnology,  Santa  Cruz,  CA).  After  the  overnight 
incubation,  membranes  were  washed  three  times  with 
1xTBST and incubated for one hour with HRP‐conjugated 
anti‐mouse  or  anti‐rabbit  IgG  (BioRad  Laboratories)  at 
room  temperature.  Blots  were  developed  using  an 
Immun‐Star  HRP  substrate  developing  kit  (BioRad 
Laboratories)  and  exposing  x‐ray  film.  Two  separate 
western  blots  were  performed  for  each  target. 
Densitometric quantification of the resulting films for IL‐
1, caspase 1 and ‐actin was performed using Un‐Scan‐it 
software (Silk Scientific, Orem, UT).  
 
2.4 Dynamic light scattering analysis 
 
Exosome preparations were diluted to ~50μg/mL to yield 
an  optimum  scattering  intensity  for  dynamic  light 
scattering  measurements,  which  were  performed  on  a 
Malvern 4700 autosizer  (Malvern  Instruments Ltd., UK) 
employing  a  20mW  helium/neon  laser  (633nm),  at  a 
constant  temperature of 25C. Light scattering  from  the 
sample was detected by a photomultiplier tube place at 
90 to the incident laser beam. The translational diffusion 
coefficient of the solutions was calculated from the time 
autocorrelation  of  the  scattered  light  intensity  and 
extracted  from  the  correlogram  using  the  method  of 
cumulants applied  in the proprietary Malvern software. 

3Safinur Atay, Carolyn D. Roberson, Cicek Gercel-Taylor and Douglas D. Taylor: 
Ovarian Cancer-derived Exosomal Fibronectin Induces Pro-inflammatory IL-1ß

www.intechopen.com



The  diameter  of  the  exosomes  were  obtained  from  the 
application of the Stokes‐Einstein equations [20].  
 
2.5 Mass spectrometry and proteomic analysis of  
ascites‐derived exosomes 
 
Specific  protein  bands  from  SDS‐PAGE  gels  of  ascites‐
derived exosomal proteins were reduced, alkylated and 
trypsinized  at  37C  overnight  with  shaking.  Briefly, 
tryptic  peptides  were  loaded  onto  a  1D  capillary 
chromatography column comprised of a needle tip (100 x 
365μm  fused  silica  capillary  with  an  integrated,  laser 
pulled  emitter  tip)  packed  with  10cm  of  Jupiter  5μm 
RP300A  (Phenomenex,  Torrence,  CA).  Peptides  were 
eluted,  ionized and sprayed  into  the mass spectrometer 
using a 120 minute gradient from 7% acetonitrile to 80% 
acetronitrile  (plus  0.1%  formic  acid)  at  a  flow  rate  of 
200nL/min. Spectra were acquired with a LTQ Orbitrap 
XL  Linear  Ion  Trap  Mass  Spectrometer  (Thermo  Fisher 
Scientific,  Waltham,  MA).  During  LC‐MS/MS  analysis, 
the  mass  spectrometer  performed  data‐dependent 
acquisition with a full MS scan between 300 and 2000m/z 
followed by MS/MS scans (35% collision energy) on the 
six most intense ions from the preceding MS scan. Data 
acquisition was performed using dynamic exclusion with 
a  repeat  count  of  a  one  and  three  minute  exclusion 
duration window.  
 
The  acquired  mass  spectrometry  data  were  searched 
against  a  translated  human  genome  database  (Human‐
RefSeqXPs) using the SEQUEST algorithm assuming fixed 
modification  of  cysteine  (+57  for  carabmidomethylation) 
and variable oxidation of methionine (+16 to methionine). 
Database  analysis  was  performed  with  SequestSorcerer 
(Sage‐N Research, San Jose, CA). High‐probability peptide 
and  protein  identifications  were  assigned  from  the 
SEQUEST  results  using  the  ProteinProphet 
(http://tools.proteomecenter.org/software.php)  and  SageN 
Sorcerer  statistical  platforms.  These  data  were  loaded 
onto  Scaffold  3  proteomic  analysis  software  to 
qualitatively  and  quantitatively  compare  individual 
LCMS  analyses  and  provide  approaches  to  functional 
annotation of data. 

 
2.6 Cytokine antibody array 
 
To  define  the  effects  of  tumour‐derived  exosomes  on 
macrophage  chemokine  and  cytokine  profiles,  their 
production by THP‐1 cells was quantified with duplicate 
arrays,  each  having  duplicate  spots  for  each  cytokine 
using  Proteome  profiler™  Human  Cytokine  Antibody 
Array Panel A Arrays (R&D Systems, Minneapolis, MN) 
according  to  the  manufacturerʹs  instructions.  THP‐1 
monocytic cells were  incubated with 100μg/ml  tumour‐
derived  exosomes  or  were  untreated  for  20  hours.  The 
cytokine  array  membranes  were  incubated  with  1ml  of 

conditioned  media  from  each  sample,  diluted  1:3  and 
15μl of Cytokine Array Panel A detection antibody at 4°C 
overnight. The membranes were then washed three times 
with  20ml  of  1×  wash  buffer  and  incubated  with 
horseradish  peroxidase‐conjugated  streptavidin  (1:2000‐
dilution). After 30 minutes, the membranes were washed 
thoroughly  and  exposed  to  a  chemiluminescent 
peroxidase substrate for five minutes in the dark before 
imaging.  Membranes  were  exposed  to  x‐ray  film 
(Research Products International, Mt Prospect, IL). As per 
the  manufacturer’s  package  insert,  the  cytokine  array 
data  on  developed  X‐ray  film  was  quantitated  by 
scanning  the  film  on  a  transmission‐mode  scanner  and 
analysing  the  array  image  file  using  image  analysis 
software,  Un‐Scan‐it  gel  digitizing  software  version  6.1 
(Silk Scientific Corporation, Orem, UT). Positive controls 
at three spots were used to identify membrane orientation 
and  to normalize  the results from different membranes. 
For each spot, the specific pixel level was determined by 
subtracting  the  background  pixels  from  the  total  raw 
pixel  levels.  To  quantify  relative  change  in  cytokine 
levels  between  samples,  the  average  background‐
subtracted  mean  spot  pixel  densities  of  the  pair  of 
duplicate  spots  representing  each  cytokine  was 
determined  for  each  condition.  To  facilitate  further 
analyses,  all  spots  in  the  arrays  were  quantified  and 
their  specific  intensity  values  were  obtained  by 
subtracting  the  background  intensity.  Only  differences 
in  cytokine  levels  that  were    two‐fold  compared  to 
controls were considered significant. 
 
2.7 ELISA determination of IL‐1 release 
 
For  ELISA  determination  of  IL‐1  human  THP‐1,  cells 
(1x106  cells/well)  were  incubated  with  exosomes  at 
100μg/ml for six hours. For the ELISA analysis, 1mM ATP 
was added for 30 minutes to induce mature IL‐1 release. 
Culture supernatants for the treated human THP‐1 cells 
were harvested and the IL‐1 levels were measured using 
IL‐1 ELISA kit (eBiosciences, San Diego, CA) according 
to the manufacturer’s instructions. 
 
2.8 Co‐Culture of THP‐1 monocytes with integrin  
function inhibitory peptides 
 
To assess IL‐1 production, THP‐1 cells (5x106 cells/well) 
were  cultured  in  RPMI  1640  supplemented  media  (as 
previously described) alone, co‐cultured with 100μg/mL 
UL‐O  culture‐derived  exosomes    (OEX),  or  co‐cultured 
with  100μg/mL  UL‐O  culture‐derived  exosomes  (OEX) 
plus  peptide  mimics  of  fibronectin  binding  (Sigma‐
Aldrich,  St.  Louis,  MO)  at  0.5mg/mL  for  30  minutes. 
Peptide mimics include: a negative control peptide (Gly‐
Arg‐Ala‐Asp‐Ser‐Pro‐Lys)  that  does  not  block  integrin 
binding (designated as CP), an antagonist peptide (Gly‐
Arg‐Gly‐Asp‐Ser)  of  integrin  function  (designated  as 

4 Exosomes microvesicles, Vol. 1, 2:2013 www.intechopen.com



ANT) and an  inhibitory peptide  (Gly‐Arg‐Gly‐Asp‐Thr‐
Pro)  of  fibronectin,  type  1  collagen  and  vitronectin 
(designated  BFCV)  [15].  Cultures  were  incubated  with 
OEX for six hours with or without the addition of 1mM 
ATP for 30 minutes at 37C. Post incubation, supernatants 
of  cultures  were  harvested  and  subjected  to  ELISA 
analysis  using  a  commercially  available  IL‐1  kit 
(eBiosciences, San Diego, CA) to determine the amount of 
IL‐1 released. 
 
2.9 Kinetics of THP‐1, OEX and integrin function  
inhibitory peptide co‐cultures  
 
THP‐1 cells were unstimulated, stimulated with OEX, or 
stimulated  with  OEX  +  peptide  mimics  of  fibronectin 
binding  (as previously described) for 0, 30, 60, 120, or 240 
minutes.  Total  intracellular  protein  extracts  were 
prepared by adding 100μL of RIPA buffer plus protease 
and  phosphatase  inhibitors/106  cells  (ThermoScientific). 
The  extracts  were  incubated  on  ice  for  30  minutes  and 
centrifuged  at  12,000rpm  for  ten  minutes.  Protein 
concentration  was  determined  using  the  DC  Protein 
Assay (BioRad Laboratories). Cellular protein (30μg) was 
added  to  Laemmli  reducing  buffer  and  boiled  for  five 
minutes.  Samples  were  electrophoresed  at  100V  for  1.5 
hours  and  the  resulting  gel  was  transferred  to 
nitrocellulose  membranes  (BioRad  Laboratories)  at  98V 
for one hour on  ice. Membranes were blocked with 5% 
non‐fat dry milk in 1xTBS + 0.05% Tween 20 (1xTBST) for 
one hour and incubated on a rocker overnight at 4C with 
anti  p‐Akt2  (clone  B5),  anti  pser73  c‐Jun  and  anti‐‐actin 
(clone  C‐4).  All  antibodies  are  from  Santa  Cruz 
Biotechnology. After an overnight incubation, membranes 
were  washed  three  times  with  1xTBST  and  incubated  at 
room temperature for one hour with HRP‐conjugated anti‐
mouse  or  anti‐rabbit  IgG  (BioRad  Laboratories). 
Subsequently, membranes were developed using Immun‐
Star HRP Chemiluminescent Kit (BioRad Laboratories) and 
visualized  on  Biomax  MR  film  (Kodak).  Western  blot 
images  for  p‐Akt2,  pSer73  cJun  and  ‐actin  were  digitized 
and relative change in expression of protein in comparison 
to  the  control  was  quantified.  Statistical  analyses  were 
performed using the t‐test and calculated using Graph Pad 
Prism‐5.01 graphing and statistical software. A p‐value of 
<0.05 was considered statistically significant. 
 
2.10 Statistical analysis 
 
Comparisons  between  exosome‐treated  and  untreated 
cells  were  performed  using  a  t‐test  or  one‐way  Anova 
with  Bonferroni’s  multiple  comparison  test,  calculated 
using  GraphPad  Prism‐5  graphing  and  statistical 
software. A p value of <0.05 was considered statistically 
significant. 
 
 

3. Results  
 
3.1 Characterization of vesicles derived from  
ascites and cell culture 
 
Assessment of vesicles derived from both in vivo and in 
vitro  by  SDS‐PAGE  (Figure  1A)  revealed  similar 
composition  of  the  major  protein  components.  These 
protein  bands  ranged  from  250kD  to  20kD.  The 
electrophoretic protein pattern for vesicles isolated from 
patient UL‐L and from culture media of UL‐O cells were 
virtually identical. Vesicles derived from patient UL‐TB 
were  similar  to  vesicles  from  UL‐L  with  additional 
bands  at  250kD  and  150kD.  The  size  of  these  vesicles 
was  then  analysed  using  Dynamic  light  scattering 
(Figure 1B)  
 
Vesicles  isolated  from  the  conditioned  media  of  UL‐O 
cells  demonstrated  a  mean  diameter  of  112.6  ±  9.0nm. 
This mean diameter size is within the general size range 
described for exosomes and is consistent with our recent 
findings with Nanoparticle Tracking Analysis [21]. 
 
3.2 Presence of fibronectin associated with patient  
ascites‐derived vesicles  
 
The protein composition of the vesicles isolated from the 
ascites  of  ovarian  cancer  patients  was  defined  by  MS 
sequencing. Proteins from 
 

 
Figure 1. Protein profiles obtained  from SDS‐PAGE of vesicles 
isolated from patients UL‐L and UL‐TB ascites and from culture 
media from UL‐O (OEX). Panel A: Imperial purple stained gel of 
UL‐L and UL‐TB ascites derived vesicles and OEX vesicles. Panel 
B:  Dynamic  light  scattering  size  determination  of  vesicles 
isolated from cell cultures of UL‐O.  
 
These vesicles were separated by SDS‐PAGE. To identify 
vesicular  proteins,  bands  were  cut  from  the  gel  and 
subjected  to  MS  sequencing.  Three  specific  bands 
produced clear sequences with high ion scores (Figure 2). 
Of these 3 bands, band one was identified as fibronectin.  
 

5Safinur Atay, Carolyn D. Roberson, Cicek Gercel-Taylor and Douglas D. Taylor: 
Ovarian Cancer-derived Exosomal Fibronectin Induces Pro-inflammatory IL-1ß

www.intechopen.com



 

Figure 2. Mass spectrometric determination of specific proteins 
associated with patient‐ascites derived vesicles. Panel A presents 
the Imperial purple stained 10% SDS‐PAGE of vesicular proteins 
from  UL‐L  and  UL‐TB.  Panel B  shows  the  mass  spectrometry 
defined  proteins  from  bands  one,  two  and  three  with  the 
corresponding peptide count and ion score.  
 
Since  previous  studies  have  demonstrated  the  role  of 
tumour cell‐associated fibronectin in the induction of IL‐
1β, the presence of fibronectin was confirmed on vesicles 
isolated  in  vitro  from  conditioned  media  of  UL‐O  cells 
(OEX, Figure 3A) and in vivo from ovarian cancer patients 
(UL‐L,  UL‐O  and  UL‐TB,  as  well  as  normal  control, 
Figure 3B). These results confirm the enhanced presence 
of  fibronectin  on  these  tumour‐derived  vesicles.  In 
addition, specific markers were evaluated between UL‐O 
cells and  their corresponding vesicles  (OEX, Figure 3A) 
using  Western  immunoblotting.  These  results  also 
demonstrated  the  enriched  presence  of  CD63  on  the 
vesicles, establishing their identity as exosomes. 
 

 
Figure 3. Western immunoblot identification of specific protein 
markers on cells and corresponding extracellular vesicles. Panel 
A presents markers associated with UL‐O cells and extracellular 
vesicles released by UL‐O cells (OEX). Panel B presents presence 
of  fibronectin  with  extracellular  vesicles  isolated  from  normal 
human AB serm (normal) and three ovarian cancer patients. 
 
3.3 Exosome induction of IL‐1 release by human macrophages  
 
Since the presence of tumours has been  linked with the 
induction of a pro‐inflammatory microenvironment. The 
initial question was whether exosomes derived from an 
ovarian tumour would induce the THP‐1 cells to produce 
a pro‐inflammatory profile. Using the Proteome profiler 
Human  Cytokine  Antibody  Array  Panel  A  Array,  the 
induction of multiple cytokines/chemokines by  tumour‐ 
 

derived  OEX  was  evaluated  (Figure  4).  When  THP‐1 
monocytic cells were  incubated with 100μg/ml  tumour‐
derived  exosomes,  14  of  the  36  cytokines/chemokines 
were induced by greater than two‐fold. Of these, GRO, 
IL‐1, IL‐1, IL‐8, IL‐23, MCP‐1 (CCL2), MIP1 and TNF 
were  induced  by  more  than  20‐fold  (versus  the  control 
treated). Of particular interest was that IL‐1 was induced 
by  350‐fold  following  exposure  to  tumour‐derived 
exosomes.  
 
Based  on  this  major  induction  of  IL‐1,  the  exosome 
component  that  might  mediate  this  pathway  was 
evaluated.  Based  on  our  previous  mass  spectrometric 
evaluation of exosomal components, the potential role of 
fibronectin  in  this  exosome‐induction  was  analysed. 
Fibronectin  has  been  reported  to  utilize  an  RGD 
(Arginine‐Glycine‐Aspartic  acid)  binding  motif  for  its 
binding  to  integrins  (specifically  51)  localized  at  the 
plasma  membrane  of  macrophages  to  induce  IL‐1 
production.  To  assess  the  role  of  exosome‐associated 
fibronectin  on  IL‐1  induction,  commercially  available 
RGD  sequence  mimics  were  used.  Incubation  of  OEX 
with THP‐1 cells resulted in the production and release of 
IL‐1.  The  negative  control  mimic  peptide  (CP),  which 
does  not  block  integrin  binding  of  fibronectin,  was 
included  as  a  negative  control.  In  Figure  5,  CP  was 
observed not to exhibit any effect on IL‐1β production or 
release.  In  contrast,  the  two  mimic  peptides  (ANT  and 
BFCV), known to inhibit fibronectin binding to integrins, 
significantly  suppressed  IL‐1  release  by  THP‐1  cells 
(p<0.001).  In  contrast  to  previous  studies  using 
trophoblast‐derived  exosomes,  IL‐1  production  and 
release  is  induced by  tumour‐derived exosomes  in both 
the absence and presence of ATP. 
 

 
Figure 4. Exosome induction of cytokines/chemokines in THP‐1 
cells, incubated with 100μg/ml OEX (derived from UL‐O ovarian 
tumour  cells)  for  20  hours.  The  plot  presents  the  average 
background‐subtracted mean spot pixel densities of the pair of 
duplicate spots representing each cytokine, divided by the value 
for control THP‐1 cells. Means and standard deviations from two 
independent studies are shown  Only values greater  than  two‐
fold were considered significant and shown on the graph.  
 

6 Exosomes microvesicles, Vol. 1, 2:2013 www.intechopen.com



 
Figure 5. Exosome‐associated fibronectin mediates the increased 
release of IL‐1β. Human THP‐1 were cultured in culture media 
only  (THP)  or  pre‐cultured  with  the  various  RGD  mimic 
peptides at 0.5mg/ml for 30 minutes. OEX (exosomes from UL‐O 
cells)  were  added  at  100μg/ml  for  6  hours,  followed  by  30 
minutes with or without ATP  (1mM) at 37°C. Supernatants of 
cultures were removed to determine the quality of IL1β protein 
released by ELISA. Means and standard deviations  from  three 
independent studies are shown with p‐values calculated using 
Studentʹs t‐test. *** indicates level of significance (p < 0.001).   
 

 
Figure 6. Phosphorylation of Akt2 and cJun, following exposure 
to  OEX.  Human  THP‐1  were  cultured  in  culture  media  only 
(THP) or pre‐cultured with the various RGD mimic peptides at 
0.5mg/ml for 30 minutes. OEX were added at 100μg/ml for 0, 30 
60, 120 and 240 minutes and THP‐1 cells were lyzed and levels of 
the  phosphorylated  Akt  and  c‐Jun  were  defined  by  Western 
immunoblotting.  Means  and  standard  deviations  from  three 
independent  studies  are  shown  are  shown  with  p‐values 
calculated using Studentʹs t‐test (p value significant p < 0.05). The 
bar at the 240 minute time point following OEX treatment was 
compared to untreated and  the peptide mimic treated samples 
were  compared  with  the  OEX  treated.  *  indicates  p<0.001,  ** 
indicated p<0.05, ns= not statistically significant.  
 
The  IL‐1  promoter  region  contains  AP1  and  c‐Jun 
transcription  factor  binding  sites.  Thus,  to  define  the 
kinetics and mechanisms of exosome induction of IL‐1, 
the time course of phosphorylation of Akt2 and c‐Jun in 
the  presence  and  absence  of  the  RGD  mimics  was 
investigated  (Figure  6).  In  untreated  THP‐1  cells,  no 
phosphorylation  was  observed  in  Akt2  and  c‐Jun 
phosphorylation  showed  a  decreasing  trend  in 
phosphorylation.  Addition  of  OEX  resulted  in  a  time‐

dependent phosphorylation of both Akt2 and c‐Jun. Pre‐
incubation with the negative control peptide (CP) did not 
significantly  alter  the  time‐dependent  phosphorylation. 
In  contrast,  both  inhibitory  mimics  (ANT  and  BVCF) 
suppressed the phosphorylation of both Akt2 and c‐Jun 
to background levels.  
 
4. Discussion 
 
While previous studies have demonstrated that tumour‐
derived  exosomes  can  directly  suppress  activation  and 
proliferation  of  CD4  and  CD8  lymphocytes  [22]  and 
induce  T  regulatory  cells  [23]  and  myeloid  derived 
suppressor  cells  [24],  this  study  focuses  on  their 
consequences for macrophages. Macrophages are critical 
to both the innate and adaptive immune response, as they 
rapidly  respond  to  changes  within  their 
microenvironment.  In  general,  inflammation  from 
pathogens  or  tissue  damage  can  activate  resident 
macrophages to initiate or amplify the production of pro‐
inflammatory  cytokines  and  other  inflammatory 
mediators  [25].  This  current  study  addresses  the 
mechanism  underlying  exosome‐mediated  induction  of 
IL‐1  by  macrophages,  observed  in  cancer.  In  vitro, 
macrophages can be phenotypically polarized to the M1 
state  by  treatment  with  IFN‐γ  and  inducers  of  TNF‐α, 
such as  lipopolysaccharide  (LPS)  [26]. M1 macrophages 
produce  pro‐inflammatory  cytokines  and  chemokines, 
including  TNF‐α,  IL‐12,  IL‐6,  CCL2  and  IL‐1β  [4,  5]. 
Elevated  levels  of  IL‐1β  are  present  in  M1  polarized 
macrophages due to activation of the NF‐κB and MAPK 
pathways  [27],  while  no  IL‐1β  protein  is  found  in  M2 
polarized macrophages [28]. 
 
IL‐1 exhibits profound effects on  immune cell function 
during inflammation, resulting in investigations focused 
on factors that control IL‐1 expression. Stimuli known to 
regulate  IL‐1  production  in  vitro  include  bacterial 
lipopolysaccharide,  adherence  to  plastic,  certain  viral 
infections  such  as  cytomegalovirus,  phorbol  myristate 
acetate,  macrophage  ingestion  of  asbestos  fibres  and 
certain  cytokines,  including  tumour  necrosis  factor‐, 
granulocyte‐macrophage  colony  stimulating  factor  and 
IL‐1  itself  [29]. While  these  factors are  important  in  the 
regulation of IL‐1 expression, the mechanisms by which 
they  modulate  IL‐1  expression  in vivo  remain  unclear. 
Extracellular  matrices  (ECM)  are  also  capable  of 
stimulating  the  expression  of  IL‐1  [30].  Fibronectin  is 
highly  expressed  in  injured  tissues  and  appears  to  be 
positioned  to  modulate  the  expression  of  IL‐1  in 
diseased  tissues  [30].  Since  multiple  components  have 
been implicated in the induction of the pro‐inflammatory 
microenvironment  associated  the  cancer,  the  protein 
composition  of  the  vesicles  isolated  from  the  ascites  of 
ovarian  cancer  patients  was  analysed.  The  presence  of 
fibronectin of vesicles  isolated from cancer patients and 

7Safinur Atay, Carolyn D. Roberson, Cicek Gercel-Taylor and Douglas D. Taylor: 
Ovarian Cancer-derived Exosomal Fibronectin Induces Pro-inflammatory IL-1ß

www.intechopen.com



from vesicles obtained from ovarian cancer patients was 
demonstrated  by  mass  spectrometric  sequencing  and 
confirmed by Western immunoblotting (Figures 2 and 3). 
The  ability  of  this  exosome‐associated  fibronectin  to 
induce the release of IL‐1β was further investigated. Our 
studies  demonstrate  the  exposure  of  THP‐1  cells  to 
tumour‐derived  exosomes  induced  the  significant 
production  and  release  of  pro‐inflammatory 
cytokines/chemokines, including of particular note IL‐1β 
(Figure 4).  
 
In  vitro,  fibronectin  stimulates  the  expression  of  IL‐1 
mRNA  and  its  translation  into  the  31kDa  intracellular 
precursor  protein,  along  with  secretion  of  the  17kDa 
active form in human mononuclear cells [31]. This effect 
of fibronectin is mediated by the specific cell surface 51 
integrin  receptor,  which  activates  poorly  understood 
intracellular  signals  to  induce  IL‐1  expression  [32]. 
Fibronectin  contains  a  sequence,  termed  Arg‐Gly‐Asp 
(RGD),  which  promotes  its  attachment  to  integrin 
receptors. Monocytes and macrophages have been shown 
to possess  fibronectin receptors  that recognize  the RGD 
motif  and  mediate  pro‐inflammatory  cytokine 
production. The effect of fibronectin has been shown to 
be  dependent  on  binding  of  the  RGD  sequence  of 
fibronectin  to  integrin  receptors,  as  this  effect  could  be 
inhibited  by  integrin  receptor  blocking  peptides  (anti‐
RGD sequence mimics) [33].  
 
IL‐1β post‐translational processing and release is a highly 
regulated  pathway  utilizing  a  multiprotein  complex, 
termed the capase‐1 inflammasome [34]. IL‐1β is initially 
synthesized as a 34kD precursor protein that is cleaved to 
the  biologically  active  17kD  form  by  active  caspase‐1. 
Inactive  pro‐caspase‐1  is  constitutively  present  in  both 
M1  and  M2  macrophages  and  is  activated  within  M1 
macrophages  by  self‐cleavage,  occurring  in  the 
inflammasome complex. The nucleotide‐binding domain 
and leucine‐rich repeat receptor containing pyrin domain 
3  (NLRP3)  inflammasome  can  be  activated  by  specific 
microbial motifs, by microbial toxins, by uric acid crystals 
and by extracellular ATP acting through the ATP‐gated 
plasma  membrane  ion  channel,  the  P2X7  receptor. 
Addition  of  extracellular  ATP  to  macrophages  can 
generally increase the release of mature IL‐1. In contrast 
to  our  previous  study  using  trophoblast‐derived 
exosomes,  tumour‐derived  exosomes  do  not  require 
addition of ATP to induce release of IL‐1 (Figure 5). It is 
unclear  whether  these  exosomes  carry  ATP  or  utilize  a 
distinct pathway to induce the production and release of 
IL‐1.  However,  these  possibilities  are  currently  under 
investigation.  
 
The  IL‐1  promoter  region  contains  AP1  and  c‐Jun 
transcription  factor  binding  sites  that  are  critical  to 
mediate  certain  pathologic  conditions.  Our  results 

demonstrate  that  tumour  exosomes  induce  IL‐1  and 
produce  phosphorylation  of  Akt2  and  c‐Jun  (Figure  6). 
The  addition  of  the  RGD  mimics  resulted  in  the 
suppression  of  Akt2  and  c‐Jun  phosphorylation, 
following  addition  of  UL‐O  exosomes.  These  findings 
confirm  the  essential  role  of  exosome‐associated 
fibronectin  in  the  regulatory  events  leading  to  the 
promotion of IL‐1β production and release.  
 
While  other  studies  have  investigated  the  role  of 
fibronectin and other components of  the ECMs on  the 
induction of IL‐1, in the current study, we demonstrate 
IL‐1 induction by fibronectin associated with tumour‐
derived  exosomes.  This  study  with  ovarian  cancer‐
derived  exosomes  demonstrates  that  these  tumour 
exosomes also express  fibronectin, which may account 
for the pro‐inflammatory microenvironment observed in 
cancer.  Exposure  of  macrophages  to  ovarian  tumour‐
derived  exosomes  appears  to  “educate”  these  cells  to 
M1 macrophages. These M1 macrophages produce pro‐
inflammatory  cytokines  and  chemokines,  including 
TNF‐α, IL‐8, MCP‐1 (CCL2) and IL‐1β. While enhanced 
levels of IL‐1 characterize M1 polarized macrophages, 
IL‐1  is  absence  in  M2  polarized  macrophages  [24]. 
These findings may have implications for the potential 
use  of  exosome‐associated  fibronectin  as  potential 
biomarkers for cancers. Exosome‐associated fibronectin 
may  also  serve  as  a  therapeutic  target  for  cancer,  by 
targeting  the  fibronectin‐induced  pro‐inflammatory 
environment  essential  for  tumour  growth  and 
proliferation.  
 
7. References 
 
[1] Allavena  P,  Mantovani  A  (2012)  Tumor‐associated 

macrophages: Undisputed stars of the inflammatory 
tumour microenvironment. Clin. Exp. Immunol. 167: 
195‐205. 

[2] Ohri CM, Shikotra A, Green RH, Waller DA, Bradding 
P  (2011)  The  tissue  microlocalisation  and  cellular 
expression  of  CD163,  VEGF,  HLA‐DR,  iNOS  and 
MRP 8/14 is correlated to clinical outcome in NSCLC. 
PLoS One 6: e21874.  

[3] Romagnani S  (2000) T‐cell subsets (Th1 versus Th2). 
Ann. Allergy Asthma Immunol. 85: 9–18.  

[4] Martinez FO, Gordon S, Locati M, Mantovani A (2006) 
Transcriptional profiling of the human monocyte‐to‐
macrophage  differentiation  and  polarization:  new 
molecules  and  patterns  of  gene  expression.  J. 
Immunol. 7: 7303–7311.  

[5] Gordon  S  (2003)  Alternative  activation  of 
macrophages. Nature Rev. Immunol. 3: 23–35.  

[6] Mahmoud  SM,  Lee  AH,  Paish  EC,  Macmillan  RD, 
Ellis  IO,  Green  AR  (2012)  Tumour‐infiltrating 
macrophages and clinical outcome in breast cancer. J. 
Clin. Pathol. 65: 159‐163.  

8 Exosomes microvesicles, Vol. 1, 2:2013 www.intechopen.com



[7] Laoui  D,  Movahedi  K,  VanOvermeire  E,  Van  den 
Bossche  J,  Schouppe  E,  Mommer  C,  Nikolaou  A, 
Morias  Y,  De  Baetselier  P,  Van  Ginderachter  JA 
(2011)  Tumor  associated  macrophages  in  breast 
cancer: Distinct subsets, distinct functions. Int. J. Dev. 
Biol. 55:861‐867. 

[8] Bonde  AK,  Tischler  V,  Kumar  S,  Soltermann  A, 
Schwendener  R  (2012)  Intratumoral  macrophages 
contribute  to  epithelial‐mesenchymal  transition  in 
solid tumors. BMC Cancer 12: 35.    

[9] Kaczmarek M, Nowicka A, Kozlowska M, Zurawski J, 
Batura‐Gabryel H, Sikora J (2011) Evaluation of the 
phenotype  pattern  of  macrophages  isolated  from 
malignant  and  non‐malignant  pleural  effusions. 
Tumour Biol. 32: 1123‐1132. 

[10] Sprowl JA, Reed K, Armstrong S, Lanner C, Guo B, 
Kalatskaya  I,  Stein  L,  Hembruff  SL,  Parissenti  AM 
(2012) Alterations in tumor necrosis factor signaling 
pathways  are  associated  with  cytotoxicity  and 
resistance  to  taxanes:  A  study  in  isogenic  resistant 
tumor cells. Breast Cancer Res. 14: R2. 

[11] Engert  S,  Rieger  L,  Kapp  M,  Becker  JC,  Dietl  J, 
Kammerer U (2007) Profiling chemokines, cytokines 
and  growth  factors  in  human  early  pregnancy 
deciduas by protein array. Am. J. Reprod. Immunol. 
58: 129‐137.  

[12] Atay S, Gercel‐Taylor C, Suttles J, Mor G, Taylor DD 
(2011)  Trophoblast‐derived  exosomes  mediate 
monocyte  recruitment  and  differentiation.  Am.  J. 
Reprod. Immunol. 65: 65‐77.  

[13] Schiffer  R,  Klein  B,  Klosterhalfen  B,  Zwadlo‐
Klarwasser  G  (1999)  The  contact  of  human 
macrophages  with  extracellular  matrix  proteins 
selectively  induces  expression  of  proinflammatory 
cytokines. Pathobiol. 67: 233‐235.  

[14] Humphries  MJ  (1993)  Fibronectin  and  cancer: 
rationales  for  the  use  of  anti‐adhesives  in  cancer 
treatment. Semin. Cancer Biol. 4: 293‐299.    

[15] Zetter  BR  (1993)  Adhesion  molecules  in 
tumormetastasis. Semin. Cancer Biol. 4: 219‐229.   

[16] Inufusa  H,  Nakamura  M,  Adachi  T,  Nakatani  Y, 
Shindo K, Yasutomi M, et al.  (1995) Localization of 
oncofetal and normal fibronectin in colorectal cancer. 
Correlation  with  histologic  grade,  liver  metastasis, 
and prognosis. Cancer 75: 2802‐2808.    

[17] Matsuura  H,  Hakomori  S  (1985)  The  oncofetal 
domain  of  fibronectin  defined  by  monoclonal 
antibody  FDC‐6:  its  presence  in  fibronectins  from 
fetal and tumor tissues and its absence in those from 
normal adult  tissues and plasma. Proc. Natl. Acad. 
Sci. USA 82: 6517‐6521.   

[18] Loridon‐Rosa  B,  Vielh  P,  Matsuura  H,  Clausen  H, 
Cuadrado C, Burtin P (1990) Distribution of oncofetal 
fibronectin  in  human  mammary  tumors: 
immunofluorescence  study  on  histological  sections. 
Cancer Res. 50: 1608‐1612.   

[19] Brown  R,  Clugston  C,  Burns  P,  Edlin  A,  Vasey  P, 
Vojtesek B, Kaye SB (1993) Increased accumulation of 
p53  protein  in  cisplatin‐resistant  ovarian  cell  lines, 
Int. J. Cancer 55: 678‐684.  

[20] Kesimer M, Scull M, Brighton B, DeMaria G, Burns K, 
OʹNeal  W,  Pickles  RJ,  Sheehan  JK  (2009) 
Characterization  of  exosome‐like  vesicles  released 
from  human  tracheobronchial  ciliated  epithelium:  a 
possible role in innate defense. FASEB J. 23: 1858–1868. 

[21] Gercel‐Taylor  C,  Atay  S,  Tullis  RH,  Kesimer  M, 
Taylor DD (2012) Nanoparticle analysis of circulating 
cell‐derived vesicles in ovarian cancer patients. Anal. 
Biochem. 428: 44‐53. 

[22] Taylor DD, Gercel‐Taylor C  (2005) Tumour‐derived 
exosomes  and  their  role  in  cancer‐associated  T  cell 
signaling defects. Br. J. Cancer 92: 305‐311. 

[23] Szajnik  M,  Czystowska  M,  Szczepanski  MJ, 
Mandapathil M, Whiteside TL (2010) Tumor‐derived 
microvesicles  induce,  expand  and  up‐regulate 
biological  activities  of  human  regulatory  T  cells 
(Treg). PLoS One 5: e11469. 

[24] Xiang X, Liu Y, Zhuang X, Zhang S, Michalek S, Taylor 
DD,  Grizzle  W,  Zhang  HG  (2010)  TLR2‐mediated 
expansion  of  MDSC  is  dependent  on  the  source  of 
tumor exosomes. Am. J. Pathol. 177: 1606‐1610. 

[25] Martinez FO, Sica A, Mantovani A, Locati M (2008) 
Macrophage  activation  and  polarization.  Front. 
Biosci. 13: 453–461.  

[26] Ehrt S, Schnappinger D, Bekiranov S, Drenkow J, Shi 
S, Gingeras TR, Gaasterland T, Schoolnik G, Nathan 
C  (2001)  Reprogramming  of  the  macrophage 
transcriptome  in response to  interferon‐gamma and 
Mycobacterium tuberculosis: signaling roles of nitric 
oxide synthase‐2 and phagocyte oxidase. J. Exp. Med. 
194: 1123–1140. 

[27] Dinarello CA (1996) Biologic basis for interleukin‐1 in 
disease. Blood 87: 2095–2147. 

[28] Scotton CJ, Martinez FO, Smelt MJ, Sironi M, Locati 
M,  Mantovani  A,  Sozzani  S  (2005)  Transcriptional 
profiling reveals complex regulation of the monocyte 
IL‐1 beta system by IL‐13. J. Immunol. 174: 834–845. 

[29] Danis VA, Kulesz AJ, Nelson DS, Brooks PM (1990) 
Cytokine regulation of human monocyte interleukin‐
1  (IL‐1)  production  in  vitro.  Enhancement  of  IL‐1 
production  by  interferon  (IFN)  gamma,  tumor 
necrosis  factor‐alpha,  IL‐2,  and  IL‐1,  and  inhibition 
by IFN‐alpha. Clin. Exp. Immunol. 80: 435–443.  

[30] Roman  J,  Ritzenthaler  JD,  Fenton  MJ,  Roser  S, 
Schuyler W  (2000) Transcriptional regulation of  the 
human interleukin‐1beta gene by fibronectin: role of 
protein  kinase  C  and  activator  protein  1  (AP‐1). 
Cytokine 12: 1581‐1589.  

[31] Graves K, Roman J (1996) Fibronectin modulates the 
expression  of  interleukin‐1  and  its  receptor 
antagonist  in  human  mononuclear  cells.  Am.  J. 
Physiol. 271: L61–L69.  

9Safinur Atay, Carolyn D. Roberson, Cicek Gercel-Taylor and Douglas D. Taylor: 
Ovarian Cancer-derived Exosomal Fibronectin Induces Pro-inflammatory IL-1ß

www.intechopen.com



[32] Pacifici R, Roman J, Kimble R, Civitelli R, Brownfield 
CM, Bizzarri C  (1994) Ligand binding  to monocyte 
alpha 5 beta 1  integrin activates  the alpha 2 beta 1 
receptor via the alpha 5 subunit cytoplasmic domain 
and protein kinase C. J. Immunol. 153: 2222–2233. 

[33] Ruoslahti  E  (1996)  RGD  and  other  recognition 
sequences for integrins. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 12: 
697‐715. 

[34] Martinon  F,  Burns  K,  Tschopp  J  (2002)  The 
inflammasome:  a  molecular  platform  triggering 
activation of  inflammatory caspases and processing 
of proIL‐1beta. Mol. Cell 10: 417–426.  

 
 
 
 

 

10 Exosomes microvesicles, Vol. 1, 2:2013 www.intechopen.com