IndoChem JURNAL FARMASI SAINS DAN KOMUNITAS, November 2015, hlm. 66-69 Vol. 12 No. 2 ISSN: 1693-5683 *Email korespondensi: clarafelicia0911@gmail.com UJI IN SILICO SENYAWA COUMESTROL SEBAGAI LIGAN RESEPTOR ESTROGEN ALFA Felicia*), Enade Perdana Istyastono Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta Abstract: Breast cancer is a cancer caused by uncontrolled cell growth at breast tissue. One of the most common triggers of breast cancer is overexpression of estrogen receptor alpha (ERα). This research’s goal is to test the ability of coumestrol as the ligand of ERα with in silico method and to discover coumestrol’s binding pose inside the ERα’s binding pocket. Coumestrol’s ability as ERα’s ligand was tested using structure-based virtual screening (SVBS) method by Setiawati et al. (2014) that had been modified by Istyastono (2015). Results analysis was done using decision tree generated from recursive partition and regression tree method (RPART). If coumestrol is a ligand based on decision tree, it is concluded that coumestrol is active as ligand of ERα. At the end of analysis, coumestrol’s pose inside ERα’s binding pocket was visualized using MacPyMol. From the test acknowledged that the smallest ChemPLP value of coumestrol’s pose was -83.1487. Coumestrol interacts with GLY420, ARG394, and GLU353 using hydrogen bonds. However, coumestrol were perceived as decoy according to decision tree. Hence, coumestrol could not be recognized as ERα’s ligand by the protocol. Therefore, development of proper protocol to indentify ligand for ERα is required. Keywords: Coumestrol, breast cancer, SBVS, estrogen receptor alpha, in silico 1. Pendahuluan Kanker payudara adalah kanker yang terjadi akibat pertumbuhan sel payudara yang tidak terkendali (National Cancer Institute, 2014). Berdasar data statistik World Health Organization (WHO), kanker payudara merupakan kanker yang paling sering terjadi pada wanita di 140 dari 184 negara di seluruh dunia. WHO mencatat 522.000 kematian wanita akibat kanker payudara pada tahun 2012 (International Agency for Research on Cancer WHO, 2013). Menurut Liao et al. (2014), ekspresi reseptor estrogen alfa (REα) yang tinggi berkorelasi dekat dengan proliferasi sel kanker payudara. Kedekatan korelasi ini menjadikan REα target yang potensial untuk terapi kanker payudara. Oleh karena itu, perlu dikembangkan suatu senyawa alam yang berpotensi menghambat aktivitas REα. Coumestrol termasuk senyawa organik alami golongan coumestan yang banyak terdapat pada semanggi merah, kala chana dan kedelai (Bhagwat, Haytowitz dan Holden, 2008). Berdasarkan uji in vitro dan in vivo oleh Hopert et al. (1998), coumestrol terbukti dapat berikatan dengan REα. Coumestrol juga menunjukkan aktivitas anti- estrogenik di otak dan kelenjar pituitari yang dimediasi oleh REα berdasar uji in vivo pada estrogen receptor alpha knockout mice (ERalphaKO) (Jacob, Temple, Patisaul, Young, dan Rissman, 2001), namun uji in silico aktivitas senyawa coumestrol pada REα belum pernah dilakukan. Uji in silico mengenai aktivitas coumestrol pada REα didasarkan pada metode penambatan Penapisan Virtual Berbasis Struktur (PVBS). Dalam penelitian ini, pose coumestrol dalam kantung ikatan REα diseleksi menggunakan protokol penambatan virtual molekuler Setiawati, Riswanto, Yuliani, dan Istyastono (2014) yang dimodifikasi pada bagian post-docking analysis oleh Istyastono pada tahun 2015; perangkat lunak PLANTS 1.2 digunakan untuk melakukan simulasi penambatan virtual molekuler yang dilanjutkan dengan post- docking analysis menggunakan perangkat lunak statistik komputasional R. 2. Metode Penelitian Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah protokol penambatan virtual molekuler Setiawati, Riswanto, Yuliani, dan Istyastono (2014) (protokol penambatan) dan post-docking analysis oleh Istyastono (2015) (protokol analisis hasil), FELICIA, ISTYASTONO Jurnal Farmasi Sains dan Komunitas 67 struktur tiga dimensi coumestrol dalam bentuk .mol2 (didapat dari zinc.docking.org, kode: ZINC00001219), perangkat lunak penambatan PLANTS1.2 (Korb et al., 2009) untuk menilai pose penambatan coumestrol, SPORES (Brink dan Exner, 2008) untuk memastikan format .mol2 dapat digunakan oleh perangkat lunak PLANTS1.2, MacPyMOL1.2r1 (Lill dan Danielson, 2010) untuk menghasilkan gambar molekuler, serta R versi 3.1.1 (R Development Core Team, 2013) untuk analisis statistik. Peralatan yang digunakan adalah server dengan alamat IP 103.247.10.66, Apple Macbook 5,1 dengan spesifikasi: prosesor Intel Core 2 Duo @2GHz, RAM 2GB 1067 MHz DDR3, dengan sistem operasi Mac OS X versi 10.6.8. 2.1. Preparasi coumestrol Struktur coumestrol dalam bentuk .mol2 (coumestrol.mol2) diunduh dari ZINC (zinc.docking.org) dengan kode ZINC00001219. Struktur .mol2 coumestrol dipreparasi (modul settypes) menggunakan aplikasi SPORES agar dapat ditambatkan pada penambatan molekuler menggunakan PLANTS1.2. 2.2. Penambatan coumestrol Luaran dari SPORES ditambatkan menggunakan PLANTS1.2 sesuai protokol. Iterasi penambatan molekuler dilakukan tiga kali. Lalu, luaran berupa 3 x 50 pose berupa skor ChemPLP dipilih satu dengan skor terbaik (terendah). Prosedur penambatan coumestrol direplikasi 1000 kali, sehingga diperoleh 1000 pose terbaik masing- masing replikasi. 2.3. Tata cara analisis hasil Dilakukan analisis hasil menggunakan protokol analisis hasil. Jika berdasar decision tree coumestrol merupakan ligand, maka coumestrol dinyatakan aktif sebagai ligan pada REα. Setelah analisis hasil, dilakukan visualisai pose coumestrol dalam kantung ikatan REα. Pose coumestrol yang divisualisasikan adalah: (1) Pose yang memiliki bitstring 320 aktif dengan skor ChemPLP terendah, (2) Pose dengan skor ChemPLP terendah, (3) Jika pose pada poin (2) memiliki skor ChemPLP yang lebih rendah dari pose pada poin (1), maka kedua pose divisualisasikan. 3. Hasil dan Pembahasan Tujuan penelitian ini adalah mengetahui mengetahui kemampuan senyawa coumestrol sebagai ligan pada REα melalui protokol penambatan dan protokol analisis hasil, menguji kemampuan protokol penambatan dan protokol analisis hasil dalam mengenali coumestrol sebagai ligan pada REα dan mengetahui pose coumestrol pada tingkat atomik dalam kantung ikatan REα Gambar 1. Pose coumestrol dalam kantung ikatan REα 68 FELICIA, ISTYASTONO Jurnal Farmasi Sains dan Komunitas Tabel I. Data Aktivitas PLIF Bitstring Penting Coumestrol No. bitstring Residu Aktivitas 320 GLY420 Aktif 242 ARG394 Aktif 117 GLU353 Aktif 411 GLY521 Tidak aktif 473 CYS530 Tidak aktif 105 ASP351 Tidak aktif 201 LEU387 Tidak aktif 470 CYS530 Tidak aktif 170 TRP383 Tidak aktif 171 TRP383 Tidak aktif 323 MET421 Tidak aktif berdasar protokol penambatan dan protokol analisis hasil. Pose yang divisualisasikan (Gambar 1) merupakan pose coumestrol ke-159 dari 1000 replikasi yang dilakukan dan memiliki skor ChemPLP terendah sebesar -83,1487. Berdasar hasil visualisasi dari MacPyMol (Gambar 1) dan data aktivitas PLIF bitstring penting coumestrol (Tabel I), terlihat coumestrol berinteraksi dengan beberapa residu asam amino pada REα. Coumestrol berinteraksi dengan residu GLY420 (bitstring no. 320), ARG394 (bitstring no. 242), dan GLU353 (bitstring no. 117). Interaksi yang terjadi berupa ikatan hidrogen dengan protein sebagai akseptor pada residu GLY420 dan GLU353 dan ikatan hidrogen dengan protein sebagai donor pada residu ARG394. Dari post docking analysis menggunakan decision tree didapat hasil yang menyatakan coumestrol sebagai decoy (Gambar 2), sehingga disimpulkan coumestrol tidak bertindak sebagai ligan pada REα berdasar protokol penambatan dan protokol analisis hasil. Hasil ini bertentangan dengan hipotesis yang diajukan di awal penelitian. Mysinger et al. (2012) mendefinisikan ligan sebagai senyawa dengan afinitas ≤ 1 μM terhadap protein target; senyawa dengan afinitas ≥ 1 μM dan ≤ 30 μM sebagai ligan marginal; dan senyawa dengan Gambar 2. Hasil post docking analysis menggunakan decision tree. Garis tebal menunjukkan rute analisis yang terjadi pada coumestrol. FELICIA, ISTYASTONO Jurnal Farmasi Sains dan Komunitas 69 afinitas ≥ 30 μM sebagai pengecoh. IC50 coumestrol pada REα adalah 75,7 nM (Zhao dan Brinton, 2004), yang berarti coumestrol termasuk ligan bagi REα. Decision tree terbaik hasil metode RPART oleh Istyastono (2015) yang digunakan dalam protokol analisis hasil hanya mengidentifikasi 52,742% ligan dalam DUD-E sebagai ligan (202 dari total 383 ligan). Ketidak sesuaian hasil dengan hipotesis dapat terjadi karena coumestrol termasuk dalam 47,258% ligan yang tidak terdeteksi sebagai ligan oleh protokol analisis hasil. Perbedaan hasil dengan hipotesis menunjukkan protokol penambatan dan protokol analisis hasil masih belum mampu mendeteksi coumestrol sebagai ligan REα, sehingga masih perlu dilakukan pengembangan protokol agar mampu mengidentifikasi ligan REα. 4. Kesimpulan Berdasar protokol Setiawati et al. (2014) yang telah dimodifikasi dengan RPART sebagai post docking analysis oleh Istyastono (2015), coumestrol bukan merupakan ligan bagi REα. Daftar Pustaka American Cancer Society, 2014. Breast Cancer. American Cancer Society, USA. Bhagwat, S., Haytowitz, D.B., dan Holden, J.M., 2008. USDA Database for the Isoflavones Content of Selected Foods, Release 2.0, U.S. Departement of Agriculture, USA, 43-48. Brink, T.T., dan Exner, T.E., 2009. Influence of Protonation, Tautomeric, and Stereoisomeric States on Protein- Ligand Docking Results. Journal of Chemical Information and Modeling, 55 (9), 1962-1972. Hopert, A.C., Beyer, A., Frank, K., Strunck, E., Wiinsche, W., and Volimer, G., 1998. Characterization of Estrogenicity of Phytoestrogens in an Endrometrial- derived Experimental Model. Environmental Health Perspectives, 106 (9), 581-586. International Agency for Research on Cancer World Health Organization, 2013. Latest World Cancer Statictics Global Cancer Burden Rises to 14.1 Million New Cases in 2012: Marked Increase in Breast Cancers Must be Addressed. World Health Organization, France, 1. Istyastono, E.P., 2015. Employing Recursive Partition and Regression Tree Method to Increase The Quality of Structure-Based Virtual Screening in The Estrogen Receptor Alpha Ligands Identification. Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research, 8 (6), 207-210. Jacob, D.A., Temple, J.L., Patisaul, H.B., Young, L.J., dan Rissman, E.F., 2001. Coumestrol Antagonizes Neuroendocrine Actions of Estrogen via The Estrogen Receptor Alpha. Exp Biol Med (Maywood), 226 (4), 301. Korb, O., Stutzle, T., dan Exner, T.E., 2007. An Ant Colony Optimization Approach to Flexible Protein–Ligand Docking. Swarm Intell, 1, 115-134. Korb, O., Stutzle, T., dan Exner, T.E., 2009. Empirical Scoring Function for Advanced Protein-ligand Docking with PLANTS. Journal of Chemical Information and Modeling, 49 (1), 84-98. Liao, X.H., Lu, D.L., Wang, N., Liu, L.Y., Wang, Y., Li, Y.Q., et al., 2014. Estrogen Receptor α Mediates Proliferation of Breast Cancer MCF–7 Cells via a p21/PCNA/E2F1-dependent Pathway. The FEBS Journal, 281 (2014), 927-942. Lill, M.A., dan Danielson, M.L., 2010. Computer-aided Drug Design Platform Using PyMOL, Journal of Computer-Aided Molecular Design. 25 (1), 13-19. Mysinger, M.M., Carchia, M., Irwin, J.J., dan Shoichet, B.K., 2012. Directory of Useful Decoys, Enhanced (DUD- E): Better Ligands and Decoys for Better Benchmarking, Journal of Medicinal Chemistry. 55, 6582-6594. Setiawati, A., Riswanto, F.D.O., Yuliani, S.H., dan Istyastono, E.P., 2014. Retrospective Validation of A Structure- Based Virtual Screening Protocol to Identify Ligands for Estrogen Receptor Alpha and Its Application to Identify the Alpha-mangostin Binding Pose. Indones. J.Chem., 14 (2), 103-108. Zhao, L., dan Brinton, R.D., 2005. Structure-Based Virtual Screening for Plant-Based ERβ-Selective Ligands as Potential Preventative Theraphy against Age-Related Neurodegenerative Diseases. J. Med. Chem., 48, 3463-3466.