195 Mutiara Medika Vol. 11 No. 3: 195-200, September 2011 Aktivitas Antiproliferatif Ekstrak Metanol Daun Pereskia grandifolia Haw terhadap Berbagai Sel Kanker Antiproliferative Activity of Methanol Extract of Pereskia grandifolia Haw Leaves Against Different Human Cell Lines Aditya Krishar Karim1, Sismindari2* 1Department of Biology, Faculty of Science and Mathematic, Universitas Cenderawasih, Papua, 2Department of Pharmacy, Faculty of Pharmacy UGM Yogyakarta, Indonesia. *Email: sismindari@yahoo.com Abstrak Pereskia grandifolia (famili Cactaceae) atau biasa dikenal sebagai tanaman Tujuh jarum telah banyak dimanfaatkat masyarakat lokal di Malaysia dan China untuk mengobati berbagai jenis penyakit seperti diabetes, hipertensi, antikanker, antitumor, antiinflamasi dan antirematik. Penelitian ini bertujuan untuk mencari aktivitas antiproliferatif terhadap kultur sel kanker HCT-116, C2C12 dan 293A. Ekstrasi dilakukan secara maserasi dengan menggunakan metanol. Efek antiproliferatif diuji dengan menggunakan reagen WST-1 ((2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitro-phenyl)-5-(2,4-disulfophenyl) -2H-tetrazolium monosodium salt) selama 1, 2 dan 4 jam setelah inkubasi selama 72 jam. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak methanol daun P. grandifolia bersifat antiproliferatif terhadap sel kanker kolon HCT-116 dengan IC50 yaitu 509,83µg/ml (1 jam), 503,60µg/ml (2 jam), 519,24µg/ml (4 jam) tetapi tidak bersifat antiproliferatif terhadap sel C2C12 dan 293A. Hasil ini mengindikasikan bahwa ekstrak methanol daun P. grandifolia bersifat selektif terhadap sel kanker HCT-116. Kata kunci; Pereskian grandifolia, WST-1, HCT-116, C2C12, 293A Cell line Abstract Pereskia grandifolia (Cactaceae family) commonly known as jarum tujuh bilah. This plant com- monly used by the local community in Malaysia and Chinese for treat a variety of illnesses including diabetes, hypertension, anticancer, antitumor and anti rheumatic. The aim of this study was to investi- gate antiproliferative activity of methanol extract of P. grandifolia leaves against HCT-116, C2C12 and 293A cell line. Leaves powder extracted using methanol. Antiproliferative activity was determined by Cell Proliferation Reagents WST-1 ((2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitro-phenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium mono-sodium salt), test for 1h, 2h, and 4h after incubated for 72h. The result showed that methanol extract of P. grandifolia leaves possessed remarkable antiproliferative activity against HCT-116 cell line with IC50 values of IC50 were 509,83µg/ml (1h), 503,60µg/ml (2h), 519,24µg/ml (4h), and had no active to against C2C12 and 293A cell line. The result indicated methanol extract of P. grandifolia leaves exhibit selective antiproliferative activity against HCT-116 cell line. Key words: Pereskian grandifolia, WST-1, HCT-116, C2C12, 293A Cell line ARTIKEL PENELITIAN 196 Aditya, Aktivitas Antiproliferatif Ekstrak Metanol ... PENDAHULUAN Kanker merupakan penyakit kedua terbesar di dunia setelah penyakit kardiovaskuler yang me- nyebabkan kematian.1,2 Insiden kanker di Indone- sia diperkirakan 100 per 100.000 penduduk per tahun atau sekitar 200.00 populasi per tahun.3 Kanker terjadi akibat adanya gangguan fungsi ho- meostasis atau kegagalan mekanisme pengatur multiplikasi pada organisme multiseluler.4 Pengobatan panyakit kanker yang digunakan umumnya bekerja tidak selektif, karena mengham- bat juga sel normal yang memiliki aktivitas pem- belahan sel tinggi seperti sel sumsum tulang, epitel germinativum, mukosa saluran cerna, folikel rambut dan jaringan limfosit.5 Tumbuhan merupakan salah satu sumber obat-obatan yang telah banyak dimanfaatkan se- bagai obat antikanker, antiimflamasi, antibakteri, antioksidan. Masyarakat di dunia telah meman- faatkan tumbuhan dari alam untuk menyembuhkan berbagai macam penyakit termasuk kanker. Akhir- akhir ini banyak ditemukan senyawa dari tanaman yang memiliki aktivitas antikanker dengan efek samping yang kecil.6,7 Pereskia grandifolia merupakan salah satu tumbuhan tradisional yang telah banyak dimanfaat- kan oleh masyarakat di Malaysia dan China dalam menyembuhkan berbagai jenis penyakit seperti kanker, tekanan darah tinggi, diabetes dan penyakit yang berhubungan dengan rematik dan inflamasi.8 Tumbuhan ini termasuk famili kaktus (Cactaceae) yang mungkin satu-satunya memiliki daun sebenar- nya dan merupakan genus yang paling primitif, dapat tumbuh dan beradaptasi pada hampir semua iklim kecuali tundra.9 Genus Pereskia secara umum dikenal sebagai jarum tujuh bilah (Malaysia), sedangkan di Cina dikenal dengan nama Cak Sing Cam, di Indonesia dikenal dengan nama daun tujuh jarum.10,11,12 Kak- tus diketahui sebagai tumbuhan kering dan dikenal secara umum mampu tumbuh dalam kondisi yang kering, dan merupakan tumbuhan herba atau po- hon kecil. Famili Cactaceae diketahui terdiri dari 1.500-1.800 species.13 Doetsch et al.(1980),14 mengisolasi senyawa alkaloid p-methoxy-b-hydroxy phenethylamie, 3- methoxityramine dan tyramine dari daun P. grandi- folia, sedangkan Sahu et al.(1974),15 melaporkan berhasil mengisolasi asam oleonolic dari buah kering dari P. grandifolia. Beberapa studi menunjukkan bahwa P. grandi- folia mengandung senyawa b-sitosterol, vitamin E, phytone, 2,4-ditert-butylphenol dan campuran yang mengandung 2,4-ditert-butylphenol, methyl palmi- tate, methyl oleate dan methyl stearate, dan senya- wa-senyawa ini memiliki aktivitas sitotoksik terha- dap berbagai jenis sel kanker, dan merupakan studi pertama yang melaporkan aktivitas sitotoksik dari P. grandifolia.16 Takeiti et al.(2009)17 melaporkan genus lain dari Pereskia seperti ekstrak daun P. aculeate banyak mengandung serat alami, mineral (seperti kalsium, magnesium, mangan and zink) dan vita- min A, vitamin C dan asam folat serta banyak mengandung asam amino triptofan. Berdasarkan latar belakang di atas maka penelitian ini akan menguji aktivitas antiproliferatif ekstrak metanol daun P. grandifolia terhadap sel kanker HCT-116, C2C12 dan 2943A secara in vitro. 197 Mutiara Medika Vol. 11 No. 3: 195-200, September 2011 BAHAN DAN CARA Persiapan bahan dan ekstraksi Bahan tanaman berupa daun P. grandifolia yang tumbuh di sekitar Laboratorium LPPT, sudah berbunga dan berbuah. Tanaman tersebut selanjut- nya diidentifikasi di Laboratorium Taksonomi Tum- buhan Fakultas Biologi UGM sebagai Pereskia grandifolia. Daun yang telah dikumpulkan dicuci dengan air, dikeringkan, diblender, diayak. Serbuk diekstraksi dengan maserasi menggunakan metha- nol. Ekstrak dipekatkan dengan menggunakan evaporator. Preparasi kultur sel kanker Sel HCT-116 diperoleh dari Clinical Oncology Laboratory stock of Kawasaki Medical School, Ja- pan. Sel kanker HCT-116 ditumbuhkan di medium McCoy’S 5A medium (Gibco) yang mengandung 10% v/v Fetal Bovine Serum (FBS) (Sigma) dan di tambahkan 1%w/v Peni ci lli n-streptom ycin (Sigma). Untuk sel C2C12 dan 293A diperoleh dari koleksi Departement Moleculer and Developmen- tal Biology Laboratory, Kawasaki Medical School, Japan. C2C12 di tum buhkan pada m edi um Dulbecco’s Modified Eagle Media (DMEM, Sigma) yang mengandung 10% v/v Fetal Bovine Serum (FBS) (Sigma) dan 1% v/v kanamicin (Sigma), sedangkan sel 293A ditumbuhkan pada medium komplit yang mengandung 10% Fetal bovine se- rum (FBS), 2mM L glutamine (Gibco), Amino acids (NEAA) (Gibco)dan kehadiran 1% w/v of Penicil- li n-streptom yci n (Si gma). Kultur sel kanker diinkubasi pada suhu 37OC dengan 5% CO2. Uji aktivitas antiproliferatif secara in vitro Kultur sel dengan kepadatan 4,0x103 sel/ml (100µl) dimasukkan ke dalam sumuran (96 well microplate, Nunc-Germany) bersama suatu seri konsentrasi kadar uji ekstrak methanol daun P. grandifolia (500, 250, 125, 62.50, 31.25 dan 15.625, 7.8125 µg/ml) dengan DMSO 01% sebagai blanko dan sel dalam media sebagai control. Kemudian sumuran diinkubasi didalam incubator CO2 pada suhu 37OC dengan 5% CO2 selama 72 jam. Pada akhir masa inkubasi media dihilangkan dengan as- pirator, dan selanjutnya ditambahkan medium dan 10 µl reagen WST-1, selanjutnya diinkubasi selama 1, 2 dan 4 jam pada 37OC dengan 5%CO2. Nilai absorbasi dibaca pada panjang gelombang 450nm menggunakan ELISA reader (Type Varioskan Flash (Thermo cientific)). Persentasi viabilitas sel dihitung dengan cara jumlah sel hidup kontrol dikurangi jum- lah sel hidup perlakuan dibagi jumlah sel hidup kon- trol dikalikan 100%. Data diolah dengan mengguna- kan program Microsoft Excel. HASIL Uji sitotoksik digunakan untuk mengetahui potensi efek sitotoksik dari suatu ekstrak tumbuhan terhadap sel kanker. Data yang diperoleh diguna- kan untuk penghitungan potensi sitotoksik suatu senyawa yaitu berupa nilai Inhibition concentration (IC50). Hasil uji sitotoksitas dapat diperoleh dosis yang menyebabkan kematian sel sebesar 50% dari populasi sel. Semakin kecil IC50 suatu ekstrak maka semakin toksik ekstrak tersebut terhadap sel kan- ker yang diuji. Selain persentase kematian, tingkat toksisitas juga dapat diamati dari morfologi sel dengan menggunakan mikroskop.18 DISKUSI Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa eks- trak metanol daun P. grandifolia dengan menggu- 198 Aditya, Aktivitas Antiproliferatif Ekstrak Metanol ... nakan uji WST-1 menunjukkan aktivitas anti- proliferatif terhadap sel kanker HCT-116, dan tidak bersifat antiproliferatif terhadap sel kanker C12C12 dan 293A (Gambar 1, 2, dan 3). Hasil penelitian ini sama seperti yang di laporkan oleh Sri Nurestri (2009) yang menunjukkan bahwa ekstrak metha- nol daun P. grandifolia memiliki sifat sitotoksik terhadap sel kanker kolon HCT-116 dengan nilai IC50 53µg/ml dan diklasifikasikan memiliki aktivitas sitotoksik yang sedang. Hasil penelitian ini kemungkinan tanaman ini mengandung berbagai senyawa yang memiliki akti- vitas penghambatan terhadap pertumbuhan sel te- tapi terdapat dalam jumlah yang sangat sedikit atau bersifat selektif terhadap sel kanker. Pada peneli- tian ini juga terlihat pada pengamatan sel setelah diberikan perlakuan dengan dengan WST-1 terlihat intensitas warna antara kontrol dan perlakuan tam- pak sama pada sel C2C12 dan 293A. Peningkatan warna semakin terang menunjukkan bahwa sema- kin banyaknya formazan yang terbentuk yang diaki- batkan aktifnya enzim dehidrogenase yang dihasil- kan dari sel yang hidup. Pembentukan formazan diasumsikan berkaitan erat dengan jumlah reaksi metabolis dari sel-sel yang hidup dalam kultur sel.19 Beberapa penelitian melaporkan senyawa yang terkandung dalam suatu ekstrak yang berasal dari tanaman sering menunjukkan sifat selektif terhadap jenis sel kanker tertentu. Beberapa laporan penelitian menunjukkan aktivitas sitotoksik ekstrak metanol dari Pereskia bleo dengan menggunakan uji MTT tidak bersifat V ia bi lit as se l (% ) 0 20 40 60 80 100 120 7.8125 15,625 31.25 62.5 125 250 500 Konsentrasi (µg/ml) Gambar 3. Grafik Hubungan Viabilitas Sel 293A (%) dengan Kon sent rasi Ekstrak M eth anol dau n P. grandifolia setelah Inkubasi 72 jam pada Suhu 37OC dengan 5% CO2, dan Setelah Penambahan Reagen WST-1 untuk 1 Jam (-Merah), 2 Jam (-Biru) dan 4 Jam (-Coklat). 0 50 100 150 200 250 300 7.8125 15,625 31.25 62.5 125 250 500 Konsentrasi (µg/ml) V ia bi lit as se l (% ) Gambar 1. Grafik Hubungan Viabilitas Sel HCT-116 (%) dengan Konsentrasi Ekstrak Methanol Daun P. grandifolia Setelah Inkubasi 72 jam pada Suhu 37OC dengan 5% CO2, dan Setelah Penambahan Reagen WST-1 untuk 1 Jam (-Merah), 2 Jam (- Biru) dan 4 Jam (-Coklat). V ia bi lit as se l( % ) 0 20 40 60 80 100 120 140 7.8125 15,625 31.25 62.5 125 250 500 Konsentrasi (µg/ml) Gambar 2. Grafik Hub ungan Viabilitas Sel C2C12 (%) den gan Konsentrasi Ekstrak M et hano l P. grandifolia setalah Inkubasi 72 Jam pada Suhu 37OC dengan 5% CO2, dan Setelah Penambahan Reagen WST-1 untuk 1 Jam (-Merah), 2 Jam (- Biru) dan 4 Jam (-Coklat). 199 Mutiara Medika Vol. 11 No. 3: 195-200, September 2011 sitotoksik terhadap sel kanker payudara (MCF-7) setalah inkubasi selama 72 jam12, hal ini berbeda seperti yang dilaporkan oleh Tan et al.(2005)10, pa- da uji sitotoksik secara in vitro dengan mengguna- kan methylene blue assay menunjukkan bahwa ekstrak metanol dari P. bleo bersifat sitotoksik terhadap sel kanker payudara yang lain yaitu sel T47D setelah inkubasi selama 72 jam. Arkadiusz et al.(2001),20 melaporkan bahwa kuersetin dan dimteilsulfoksida (DMSO) merang- sang ekpresi gen Bcl2 (merupakan suatu protein pengatur proses apoptosis) pada proses mioge- nesis sel C2C12 sedangkan Ana et al.(2007),21 menunjukkan bahwa Arsenic trioxide (As2O3) yang memiliki aktivitas antikanker mengurangi jumlah sel hidup SY-5Y neuroblastoma dan sel 293 (embry- onic kidney). Pada penelitian ini terlihat bahwa ekstrak me- tanol daun P. grandifolia bersifat selektif dan anti- proliferatif terhadap sel kanker HCT-116, tetapi tidak memiliki aktivitas antiproliferatif terhadap sel kanker C2C12 atau 293A. SIMPULAN Ekstrak methanol daun P. grandifolia bersifat antiproliferatif terhadap sel kanker kolon HCT-116 dengan IC50 yaitu 509,83µg/ml (1jam), 503,60µg/ ml (2 Jam), 519,24µg/ml (4 jam) tetapi tidak bersifat antiproliferatif terhadap sel C2C12 dan 293A. UCAPAN TERIMA KASIH Kami mengucapkan terima kasih atas pembe- rian dana dari DIKTI melalui program beasiswa Sandwich 2010 dan LPPT Unit III Universitas Gadjah Mada. Kami juga mengucapkan terima kasih untuk Prof. Tsutomu Nohno, Ph.D dari De- partment Molecular and Develomental Biology, Kawasaki Medical School, Japan DAFTAR PUSTAKA 1. Alan, G.T. Progress in Cancer Care: A Ratio- nal Call to Do Better. C.A. Cancer.J. Clin, 2010; 60(1): 7-11. 2. Ahmedin, J., Rebecca, S., Jiaquan, X., & Eliza- beth, W. 2010. Cancer Statistics. C.A. Can- cer. J. Clin, 2010; 60(5):277-300. 3. Aziz, M.F., Andrijono, & Saifuddin, A.B. (Eds). Onkologi dan Ginekologi Buku Acuan Nasio- nal. Jakarta: Yayasan Bina Pustaka Sarwono Prawirohardjo. 2006. 4. DeVita,, V.T., Hellman, Jr.S., & Rosenberg, S.A. (Eds). Cancer: Principle and Practise of On- cology. 5ed. Lippincott-Raven. Philadelphia. 1997. p121-133;185-215;259-1880. 5. Li, Thomas S. C. Taiwanese Native Medicinal Plants: Phytopharmacology and Therapeutic Values. Published by CRC Press Taylor & Francis Group, Broken Sound Parkway NW. USA.p37. 2006. 6. McChesney, J.D., Sylesh, K.V & John, T.H. Plant Natural Product : Back to The Future or Into Extinction. Phytochemstry, 2007; 68(14): 2015-2022. 7. Xin, G., Xifeng, L, Yinggang, C., Mingqi, L, Shixiong, J., & Xishan, W. Rhein Induces Apoptosis of HCT-116 Human Colon Cancer Cells via Activation of The Intrinsic Apoptotic Pathway. African J.Biotech; 2011.10(61): 13244-13251. 8. Goh, K.L. Malaysian Herbacous Plants. Milllennium edn. Advanco Press. Malaysia: 2000. 200 Aditya, Aktivitas Antiproliferatif Ekstrak Metanol ... 9. Charles, B., & Erika, J.E. Investigating Pereskia and The Earliest Divergences in Cactaceae. Haseltonia. 2008; 14: 46-53. 10. Tan, M.L., Sulaiman, S.F., Najimuddin, N., Samian, R.M., & Muhammad, T.S. Methanolic Ex tract of Pereskia bleo (Kunth) D.C. (Cactaceae) Nuces Apoptosis in Breast Car- cinoma, T47D Cell Line. J.Ethno pharm, 2005; 96(1-2):287-294. 11. Sri Nurestri, A.M., Wahab, N.A., Yacob, H., Shin, S.K., Lai, H.S., Serm, L.G., & Rahman, N.S.A. Cytotoxic Activity of Pereskia bleo (Cactaceae) Against Human Cel l Lines. Inter.J.Cancer.Res, 2008; 4(1):20-27. 12. Wahab, S.I.A., Abdul, A.B., Mohan, S.M., Al- Zubairi, A.S., Elhassan, M.M., and Ibrahim, M.Y. Research Article Biological Activities of Pereskia bleo Extracts. Inter.J.Pharm, 2009; 5(1): 71-75. 13. Edwards, E.J., Nyffeler, R., & Donoghue, M.J. Basal Cactus Phylogeny: Implications of Pereskia (Cactaceae) Paraphyly for The Tran- sition to The Cactus Life Form. American J. Bot, 2005; 92(1):1177-1188. 14. Doetsch, P.W., Cassady, JM., & McLaughlin, J.L. Cactus Alkaloid: Identification of Mescaline and Other -Phenethylamin in Pereskia, Peres- kiops and Islaya by Use Fluoresecamin Conju- gate. J. Chromatograph A, 1980; 189:79-85. 15. Sahu, N.P., Banerji, N., & Chakravarti, R. N. A New Saponin of Oleanolic Acid from Pereskia grandifolia. Phytochemistry, 1974;13: 529-530. 16. Sri Nurestri, A.M., Sim, K.S., and Norhanom, A.W. Phytoche-mical and Cytotoxic Investiga- tions of Pereskia grandifolia Haw. (Cactaceae) Leaves. J. Bio. Scie, 2009;9(5): 488-493. 17. Takeiti, C.Y., Graziella, C., Antonio, G.C., Motta, E.M.P., Fernanda, P.C.Q., & Park, K.J. Nutri- tive Evaluation of a Non-Conventional Leafy Vegetable (Pereskia aculeata Miller). Inter. J.Food.Scie.Nutr, 2009;60(1):148-160. 18. Doyle, A., & Griffiths, J.B. Cell and Tissue Cul- ture for Medical Research. John Willey and Sons, Ltd. New York. 2000. 19. Francoeur, AM. and Assalian, A. Microcat: A Novel Cell Proliferation and Cytotoxicity Assay Based On WST-1. Biochem, 1996; (3):19-25. 20. Arkadiusz, O., Katarzyna, G., Wojciech, K., & Tomasz, M. Effect of Quercetin and DMSO on Skeletal Myogenesis from C2C12 Skeletal Muscle Cells with Special Reference to PKB/ Akt Activity, Myogenin and Bcl-2 Expression. Basic. Appl. Myol, 2001;(1): 31-44. 21. Ana, M.F., Frank, S., & Dietrich, B. Arsenic Tri- oxide (As2O3) Induced Calcium Signals and Cytotoxicity in Two Human Cell Lines: SY-5Y Neuroblastoma and 293 Embryonic Kidney (HEK). Toxicol. Appli. Pharmacol, 2007;220(3): 292–301.