24 Fitri Rizkia Putri, Pengaruh Salep Kitosan terhadap Penyembuhan ... Efektivitas Salep Kitosan terhadap Penyembuhan Luka Bakar Kimia pada Rattus norvegicus Chitosan Oilment Effect on Chemical Wound Healing in Rattus norvegicus Fitri Rizkia Putri1, Sri Tasminatun2* 1Program Studi Pendidikan Dokter, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas Muhammadiyah Yogyakarta 2Bagian Famakologi, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas Muhammadiyah Yogyakarta *Email: tasmi_a@yahoo.co.id Abstrak Proses penyembuhan luka adalah satu respon terkoordinasi pada cedera jaringan yang mengha- silkan kontraksi jaringan, penutupan luka, dan pemulihan. Penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa salep kitosan kadar 2,5% efektif dalam mempercepat penyembuhan luka dan meningkatkan persentase penyembuhan. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek kitosan terhadap gambaran histologis penyembuhan luka bakar kimia pada kulit melaui pengamatan ketebalan epitel dan jumlah fibroblas. Studi in vivo, tikus Sprague Dawley dibagi menjadi enam kelompok, kontrol tanpa perlakuan, kontrol vaselin, kontrol Bioplacenton®, salep kitosan dosis 1,25%, 2,5%, dan 5%. Punggung tikus diinduksi luka bakar derajat tiga dengan asam sulfat 75%. Formula kitosan dioleskan tiap hari sampai kriteria sembuh terkonfirmasi. Jaringan kulit yang telah sembuh dibuat preparat histologi dengan pewarnaan HE kemudian diukur ketebalan epitel dan jumlah fibroblasnya. Data dianalisis dengan ANOVA satu arah, dilanjutkan dengan LSD. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ketebalan epitel paling tipis dihasilkan oleh salep kitosan 5% (13,31 ± 4,05) dengan nilai signifikansi (p = 0,015). Jumlah fibroblas yang paling sedikit dihasilkan oleh salep kitosan 5% (49, 80 ± 6,01 sel) dengan nilai signifikansi (p = 0,000). Penelitian ini membuktikan bahwa dosis salep kitosan terbaik adalah 5%. Kata kunci: kitosan, luka bakar kimia, penyembuhan, gambaran histologis Abstract The process of wound healing is a set of coordinated responses to tissue injury that results in tissue contraction, closure, and restoration. Previous study had shown that chitosan ointment 2,5% is effective in promoting wound healing and increasing healing percentage. This experiment has aim to gain the chitosan effect on histological properties in chemical burn healing of skin through epithelial thickness and number of fibroblast observation. In in vivo studies, rats Sprague Dawley were divided into six groups; control without treatment, vaseline control, Bioplacenton® control, chitosan ointment dose 1.25%, 2.5%, and 5%. A third degree burn of the backskin was performed by 75% sulfate acid. Chitosan formulations were day repeatedly applied on the burned areas until the final healing process criterias were confirmed. Healing tissue was evaluated by histology preparation with HE staining then its epithe- lial thickness and number of fibroblast were measured. The datas were analyzed by one way ANOVA, followed by LSD. The results indicated that the thinnest epithelial thickness was showed on chitosan 5 % (13.31 ± 4.05) with a value of significance (p=0,015). The fewest number of fibroblast is performed on chitosan 5% (49, 80 ± 6.01 cells) with a value of significance (p = 0,000). This study proved the best chitosan ointment dose is 5%. Key words: chitosan, chemical burn wound, healing, histologic appearence ARTIKEL PENELITIANARTIKEL PENELITIAN 25 Mutiara Medika Vol. 12 No. 1: 24-30, Januari 2012 PENDAHULUAN Dalam hal pertahanan tubuh, kulit merupakan pelindung utama yang menghalangi masuknya zat- zat kimia, mikroba dan bahan yang bersifat iritatif, toksigenik maupun patogenik juga melindungi tu- buh dari cedera benturan. Semakin iritatif zat kimia- wi tersebut, semakin berat kerusakan yang terjadi.1 Berdasarkan data dari Departemen Kesehatan RI (2008), prevalensi luka bakar di Indonesia adalah 2,2%.2 Permasalahan yang dihadapi dalam penata- laksanaan luka bakar adalah proses inflamasi ber- kepanjangan menyebabkan kerapuhan jaringan yang menimbulkan diskonfigurasi struktur jaringan dan berakhir dengan deformitas bentuk dan gang- guan fungsi. Hal ini dapat dicegah dengan penata- laksaan luka fase awal yang meliputi kehilangan dan atau kerusakan epitel maupun jaringan yang menjadi struktur di bawahnya.3 Efisiensi dan efektifitas dari perbaikan jaringan yang terluka menjadi suatu pokok yang ingin selalu dikembangkan agar mencapai kesembuhan se- hingga berbagai macam strategi telah digunakan untuk mempercepat dan menyempurnakan proses penyembuhan luka.4 Kitosan adalah biopolimer alami yang berasal dari kitin, komponen utama dari kerangka Crusta- cea luar. Beberapa penelitian menyatakan kitosan efektif dalam mempercepat penyembuhan luka ka- rena mempunyai sifat spesifik yaitu adanya sifat bioaktif, biokompatibel, anti bakteri, anti jamur dan dapat terbiodegradasi.5 Penyembuhan luka adalah suatu bentuk pro- ses usaha untuk memperbaiki kerusakan jaringan yang terjadi secara fisiologi. Proses tersebut akan mengalami fase inflamasi, proliferasi, dan maturasi. Fibroblas dan epitel memiliki peranan besar dalam penyembuhan luka. Proses reepitelisasi adalah proses yang pertama kali tercetus untuk menutupi jaringan luka sehingga mencegah infeksi. Fibroblas mencetuskan terbentuknya kolagen yang memper- kuat jaringan luka.6 Penelitian Wardono (2009),7 menunjukan kitosan 2,5 % dapat mempercepat waktu penyem- buhan dan meningkatkan persentase penyembuh- an luka bakar kimia. Karena itu, perlu dilakukan penelitian mikroskopis untuk mengetahui pengaruh pem beri an ki tosan secara topi cal terhadap gambaran histologi penyembuhan luka melalui pengamatan fibroblas dan epitel. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek kitosan terhadap gambaran histologis penyembuhan luka bakar kimia pada kulit melaui pengamatan ketebalan epitel dan jumlah fibroblas. BAHAN DAN CARA Penelitian ini menggunakan model penelitian in vivo dengan hewan uji. Alat yang digunakan ada- lah cincin pembatas luka bakar (diameter 1,5 cm), alat pencukur rambut, gunting jaringan, pinset be- dah, mortir, stamper, stopwatch, mortar, sendok, toples ukuran besar, mistar dan jangka sorong, sa- rung tangan, masker, kandang tikus, timbangan ti- kus, timbangan analitik, kamera, dan sungkup anastesi. Sedangkan bahan yang digunakan ada- lah 18 ekor tikus putih (Rattus norvegicus) galur Spraque Dawley berumur 6-8 minggu dengan berat +180-230 gram, asam sulfat 75%, serbuk kitosan murni yang diperoleh dari PT. Ultratrend Biotech Indonesia, vaselin golongan album, Bioplacenton®, aether, kapas dan alkohol 70%. Penelitian dimulai dengan mengadaptasikan tikus selama 1 minggu sebelum penelitian. Bulu pada punggung kanan bawah tikus dicukur hingga 26 Fitri Rizkia Putri, Pengaruh Salep Kitosan terhadap Penyembuhan ... bersih. Tikus dibagi dalam 6 kelompok yaitu ke- lompok kontrol negatif tanpa perlakuan, kontrol ne- gatif vaselin, kontrol positif Bioplacenton®, perlaku- an salep kitosan dosis 1,25%, perlakuan salep kitosan dosis 2,5%, dan perlakuan salep kitosan dosis 5%. Pembuatan salep kitosan dilakukan de- ngan menformulasikan kitosan dengan bahan pem- bawa vaselin golongan album pada dosis 1,25%, 2,5% dan 5% kemudian salep dicampur sampai homogen. Punggung tikus dicukur bersih sehingga me- mungkinkan untuk dibuat luka bakar kimia berdia- meter 15 mm. Tikus dianestesi menggunakan ae- ther secara inhalasi menggunakan masker aneste- sia dan toples besar. Penginduksian luka akar kimia dengan diberi tetesan asam sulfat 75% ke dalam cicin pembatas dan ditunggu selama lima menit hingga terbentuk luka derajat tiga. Salep kitosan dioleskan tiap hari sampai luka sembuh. Tikus yang lukanya telah sembuh didekapitasi, diambil jaringan kulit bekas lukanya kemudian difiksasi dengan for- malin 10%. Jaringan kulit tersebut kemudian dibuat preparat histologi dengan pengecatan HE. Setelah mendapat pengecatan, preparat diamati dengan mikroskop cahaya untuk mendapatkan data mi- kroskopis yaitu ketebalan epitel dan jumlah fibro- blas. Data ketebalan epitel dan jumlah fibroblas di- olah dengan analisis ANOVA satu arah dan dilan- jutkan dengan uji LSD. HASIL Hasil penampakan jaringan kulit yang sudah sembuh ditiap kelompok dengan pengecatan HE ada- lah seperti pada Gambar 1. Gambar tersebut di- gunakan untuk menghitung rata-rata jumlah fibroblas. Tabel 1. Rata-rata Jumlah Fibroblas pada Luka Bakar Kimia Kelompok Perlakuan Rata-rata Jumlah Fibroblas Kontrol Negatif (Tanpa Perlakuan) 58,93 ± 4.83 sel a Kontrol Negatif (Vaselin) 62,47 ± 4.85 sel c Kontrol Positif (Bioplacenton®) 57,93 ± 4.89 sel a Salep Chitosan 1,25 % 52,63 ± 7.00 sel b Salep Chitosan 2,5 % 52,57 ± 6.80 sel b Salep Chitosan 5 % 49,80 ± 6.01 sel b Ket: angka yang diikuti huruf yg berbeda memiliki perbedaan yang signifikan B F E C A D Gambar 1. Gambaran Histologi Jumlah Fibroblas: A. Kontrol Negatif (Tanpa Perlakuan); B. Kontrol Negatif (Basis Salep); C. Kontrol Positif (Bioplacenton®); D. Salep Kitosan 1,25 %; E. Salep Kitosan 2,5 %; F. Salep Kitosan 5 %. Kelompok Salep Kitosan 5 % Menunjukkan Jumlah Fibroblas Paling Sedikit (HE, 40x10). 27 Mutiara Medika Vol. 12 No. 1: 24-30, Januari 2012 Gambar 2. menunjukkan penampakan jaringan kulit yang sudah sembuh ditiap kelompok dengan pengecatan HE. Gambar tersebut digunakan untuk menghitung rata-rata ketebalan epitel. DISKUSI Penelitian ini menghitung fibroblas di akhir pe- nyembuhan luka, jumlah fibroblas kelompok kitosan 5 % paling sedikit dan berbeda bermakna diban- ding kontrol negatif dan kontrol positif. Hal ini me- nunjukkan bahwa proses eliminasi fibroblas terjadi lebih awal dari kelompok kontrol karena kitosan telah mengakselerasi induksi fibroblas lebih cepat di awal fase proliferasi. Data tersebut didukung oleh beberapa penelitian yang menyebutkan bahwa fibroblas mencapai jumlah tertinggi pada hari ke- 14 setelah terjadi luka kemudian lama kelamaan menurun di hari-hari berikutnya.8 Fase awal penyembuhan luka yang biasa dise- but juga fase inflamasi, proses ini melibatkan ber- bagai sitokin, sel darah, matriks ekstraseluler, dan sel parenkim untuk membersihkan jejas, kemudian membangun dasar (scaffolding) secara progresif.9 Fase inflamasi merangkai proses biologi yang di- awali dengan platelet-induced hemostasis, diikuti oleh influks sel-sel inflamasi dan fibroblas untuk menuju area luka, pembentukan pembuluh darah baru, serta proliferasi sel-sel untuk rekonstitusi ja- ringan. Mekanisme peradangan menghasilkan res- pon yang menetralisasi dan mengeliminasi antigen seperti bakteri, benda asing atau sel mati. Selan- jutnya adalah stadium proliferasi, pembentukan ja- ringan granulasi yang diperankan oleh fibroblas mengambil peranan besar dalam stadium ini, peng- kerutan luka dan epitelialisasi hingga menutup B F C E D A Gambar 3. Gambaran histologi epitel kulit (pipih berlapis): A. Kontrol negatif (tanpa perlakuan); B. Kontrol negatif (basis salep); C. Kontrol positif (Bioplacenton®); D. Salep Kitosan 1,25 %; E. Salep Kitosan 2,5 %; F. Salep Kitosan 5 %. Kelompok salep kitosan 5 % menunjukkan ketebalan epitel paling tipis (HE, 40X10). Tabel 2. Rata- Rata Ketebalan Epitel pada Luka Bakar Kimiawi Kelompok Perlakuan Rata-rata Ketebalan Epitel Kontrol Negatif (Tanpa Perlakuan) 19.13 ± 3.50 µm a,b,c Kontrol Negatif (Vaselin) 17.28 ± 1.24 µm a,c,d Kontrol Positif (Bioplacenton®) 23.00 ± 4.70 µm b Salep Chitosan 1,25 % 20.67 ± 2.04 µm b,c Salep Chitosan 2,5 % 13.76 ± 1.06 µm a,d Salep Chitosan 5 % 13.31 ± 4.05 µm d Ket: angka yang diikuti huruf yg berbeda memiliki perbedaan yang signifikan 28 Fitri Rizkia Putri, Pengaruh Salep Kitosan terhadap Penyembuhan ... seluruh permukaan luka berlangsung 4 hari - 4 minggu.6 Pada minggu pertama fibroblas dihasilkan oleh derivat makrofag yaitu sitokin TGF- ²1, PDGF dan fibroblast growth factor (FGF) untuk memproli- ferasi dan mensintesa glikosaminoglikan, proteogli- kan dan kolagen yang berfungsi untuk merekon- struksi jaringan. Penelitian Chiba et al. (2006),10 menunjukkan bahwa hewan percobaan yang diberi kitosan me- miliki resolusi neovaskularisasi yang lebih mema- dai, induksi fibroblas yang lebih cepat, dan serat kolagen yang lebih banyak. Hal ini didukung de- ngan penelitian Masuoka et al. (2005),11 yang me- nyatakan bahwa kitosan memiliki kemampuan untuk meningkatkan paruh waktu basic Fibroblast Growth Factor dibanding kelompok kontrol dengan cara melindunginya agar tidak terdegradasi oleh panas atau enzim-enzim yang mungkin merusak- nya. Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) atau disebut juga FGF-2 adalah salah satu prototipe Fibroblast Growth Factor (FGF) yang memiliki pengaruh amat besar terhadap perkembangan ja- ringan granulasi, proliferasi fibroblas dan angioge- nesis. BFGF diaktifasi dari ECM apabila terjadi ke- rusakan jaringan seperti luka.12 Fibroblas luka me- miliki karakteristik unik dibanding fibroblas dalam jaringan normal, tampilannya myofibroblastik de- ngan ciri-ciri fenotif berupa filamen-filamen kontrak- til berlimpah, persimpangan interselular yang ra- pat dan membran nukleus yang nampak berbeda.13 Seperti halnya penelitian Sezer (2007),14 epitel yang lebih tipis lebih baik karena pada epitel yang tebal masih terjadi proses stimulasi populasi fibro- blas pada daerah luka dan peningkatan sejumlah growth factor atau mediator dengan demikian pe- nyembuhan luka yang lebih sempurna adalah jaringan yang memiliki ketebalan epitel yang pal- ing tipis. Diantara kelompok salep kitosan yang terbaik dalam menyembuhkan luka adalah salep kitosan 5% karena memiliki ketebalan epitel yang paling tipis dan perbedaannya signifikan dibanding kontrol negatif. Lapisan epitel mengalami puncak ketebalan pada hari ke- 14 kemudian menipis pada hari- hari berikutnya.15 Peningkatan ketebalan epitel yang mencapai puncaknya di hari ke-14 disebabkan oleh fibroblas yang banyak bermigrasi pada area luka khususnya di hari ke 7-14 dan perlekatan antara kolagen-fibroblas di tepi epitel luka.14 Proses terse- but menyebabkan epitel semakin menebal agar le- bih kuat dalam mengkerutkan dan menutup luka bersama-sama dengan fibroblas-kolagen. Fibro- blas mulai meninggalkan area luka bersamaan de- ngan proses reepitelisasi yang terbentuk sempurna dan aktivasi kolagen yang memulai fase maturasi. Fase proses penyembuhan yang terakhir ada- lah fase maturasi. Pada stadium ini, pembentukan pembuluh darah ke daerah luka semakin berku- rang, mulai terbentuk serat-serat kolagen, dan luka tampak sebagai jaringan parut berwarna pucat. Re- modelling unsur parenkim untuk mengembalikan fungsi jaringan dan remodeling unsur jaringan ikat untuk memperoleh ketahanan jaringan yang lebih kuat.9 SIMPULAN Kitosan berpengaruhi pada ketebalan epitel dengan dosis terbaik adalah salep kitosan 5 % yang memiliki ketebalan epitel paling tipis (13.31 ± 4.05) dan nilai signifikansi (p=0,015). Pengaruh pem- berian salep kitosan terhadap penyembuhan luka bakar kimia yang paling signifikan berdasarkan 29 Mutiara Medika Vol. 12 No. 1: 24-30, Januari 2012 parameter jumlah fibroblas adalah kelompok salep kitosan 5% dengan jumlah fibroblas sedikit (49,80 ± 6.01) dan nilai signifikansi (p=0,000). Diperlukan penelitian sejenis dengan metode observasi per minggu untuk mengetahui progesi- fitas ketebalan epitel dan fibroblas dari waktu ke waktu. Penelitian lebih lanjut diharapkan memberi- kan pengetahuan tentang ekspresi mediator infla- masi FGF, MMP dan pembentukan matriks ekstra- selluler, untuk memperjelas peran kitosan terha- dap mediator serta proses tersebut. Selain itu, uji sensitifitas kitosan pada kulit manusia sangat baik jika turut diteliti. DAFTAR PUSTAKA 1. Sularsito, S.A., & Djuanda, S. Ilmu Penyakit Kulit dan Kelamin: Dermatitis. Jakarta: Balai Penerbit FKUI. 2007. 2. Departemen Kesehatan RI. Riset Kesehatan Dasar (Riskesdas) 2007: Laporan Nasional. Jakarta. 2008. 3. Moenajat, S.B. Luka Bakar dan Penanganan- nya. Jakarta: Balai penerbit FKUI. 2003. 4. Huttenlocher, A., & Horwitz, A.R. Wound Heal- ing with Electric Potential. N Engl J Med. 2007; 356 (3): 303-304. 5. Ishihara, M., Nakanishi, K., Ono, K., Sato, M., Kikuchi, M., Saito, Y., et al. Photocrosslinkable chitosan as a dressing for wound occlusion and accelerator in healing process. Biomate- rials., 2002. 23 (3): 833-840. 6. Kumar, V., Abbas, A., Fausto, N. Pathologic Basic of Disease. Phil adel pia: El sev i er Saunders Inc, 2005. 25 – 30. 7 Wardono, A. Pengaruh Kitosan Secara Topikal Terhadap Penyembuhan Luka Bakar Kimiawi pada Kulit Tikus Putih (Rattus Novergicus) Terinduksi Asam Sulfat. KTI. Program Sarjana Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan. Uni- versitas Muhammadiyah. Yogyakarta. 2009. 8. Amadeu TP, Coulomb B, Desmouliere A, Costa AM. Cutaneous Wound Healing: Myofibro- blastic Differentiation and in vitro Models. Int J Low Extrem Wounds. 2003; 2 (2): 60-68. 9. Bisono, P. Luka, Trauma, Syok dan Bencana. Dalam: Syamsuhidajat R, Jong WD ed Buku Ajar Ilmu Bedah, Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC. 2009. 10. Chiba, Y., Kamada, A., Sugashima, S., Taya, K., Matsubuchi, S., Saito, T., et al. Effects of Intravenous Administration of Chitosan Oli- gosaccharide on The Wound Healing Process of Oral Mucosal Injury in Mice. Ohu University Dental Journal, 2006; 33 (4): 207-213. 11. Masuoka K, Ishihara M, Asazuma T, Hattori H, Matsui T, Takase B, et al. 2005. The interac- tion of chitosan with fibroblast growth factor-2 and its protection from inactivation. Biomate- rials, 2005; 26 (16): 3277-3284. 12. Fu X, Li X, Cheng B, Chen W, Sheng Z. Engi- neered Growth Factors and Cutaneous Wound Healing Success and Possible Question in the Past 10 Years. Wound Rep Regen. 2005; 13 (2): 122-130. 13. Hosgood, G. Small Animal Paediatric Medicine and Surgery.USA: Butterworth-Heinemann. 1998. 14. Sezer A. D., Hatipolu F., Cevher E., Ourtan Z., Ba_ A. L., Akbua J. Chitosan Film Containing Fucoidan as a Wound Dressing for Dermal Burn Healing: Preparation and In Vitro/In Vivo Eva- luation. AAPS Pharm Sci Tech. 2007; 8 (2):39. 30 Fitri Rizkia Putri, Pengaruh Salep Kitosan terhadap Penyembuhan ... 15 Aryenti. Pengaruh Pemberian Getah Batang Pisang Ambon (Musa Paradisiaca var Sapien- tum Lamb) Terhadap penyembuhan Luka Bakar pada Kulti Tikus Putih (Rattus norve- gicus). Tesis. Program Pasca Sarjana Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada. Yogya- karta. 2008.