6 Nepal Journal of Biotechnology. Jan. 2011, Vol. 1, No. 1: 49‐54  49  Biotechnology Society of Nepal (BSN), All rights reserved   BRIEF COMMUNICATION   In vitro cultivation and regeneration of Solanum  melongena(L.) using stem, root and leaf explants.  Bishnu Pada Ray, Lutful Hassan and Smreeti Kana Sarker  Biotechnology Laboratory, Department of Biotechnology, Bangladesh Agricultural University (BAU), Mymensingh.  Abstract  The treatment combinations was BAP (0, 2.0, 3.0 and 4.0 mg/L) and NAA (0, 0.1, 0.5, and 1.0 mg/L). The rate of  callus formation varied  in different treatments. The highest amount of callus (48.66%)  was produced on MS  medium containing 2.0 mg/l BAP and 0.5 mg/l NAA from stem and 8.2 days required for callus induction. The  number  of  shoot  regenerated  through  callus  from  stem  containing  2.0  mg/l  BAP  and  0.5  mg/l  NAA  was  3.4  (23.287%) and days required for 38.8 days.     Key words: Regeneration, BAP, NAA.    Correspondence Author:  E‐mail: bpray2003@yahoo.com  Introduction  Brinjal (Solanum melongena L.), belongs to the family  Solanaceae, is one of the most popular, palatable and  nutritious  vegetable  crop  in  Bangladesh.  It  is  thought  to  be  originated  in  Indian  subcontinent  with  the  secondary  centre  of  origin  in  China  (Zeven  and  Zhukovsky, 1975). Brinjal  is cultivated throughout the  entire  tropics  and  sub‐tropics.  It  has  higher  calorie,  iron, phosphorus and riboflavin than tomato. Brinjal is  the second most important vegetable crop after potato  in respect of total acreage (million ha) and production  (370,000 mt) in Bangladesh (BBS, 2003). It also plays a  vital  role  in  the  national  economy  as  a  cash  crop.  Brinjal  is  highly  susceptible  to  different  insects,  pests  and  diseases  that  exert  a  deleterious  effect  on  yield,  market quality, storability and international germplasm  distribution.  The  seed‐borne  pathogens  of  previous  years  can  be  perpetuated  over  the  generations  with  symptoms expressed. To overcome this situation, plant  tissue culture offers an efficient method for pathogen  free  materials  and  germplasm  preservation  of  plants.  The potential value of tissue culture in plant breeding  has been widely recognized, and it is generally used as  useful  tool  for  crop  improvement.  Regeneration  of  valuable economic plants through tissue culture based  on the principle of totipotency,  individual plant cell  is  capable  of  regenerating  new  plantlets.  Anwar  et  al.  (2002)  cultured  the  aborigine  leaf  explants  on  MS  media containing IAA, BA (benzyl adenine), IBA, NAA or  2,4‐D at 2 mg/l. NAA produced greenish, fast‐growing  callus. 2, 4‐D induced early callus production from the  petiole, while BA induced green callus production from  the upper surface of the  lamina. The addition of NAA  or  IBA  at  0.5  mg/l  in  BA  supplemented  medium  increased  the  mass  production  of  callus  and  shoot  regeneration. The regeneration efficiency of the plant  decreased in MS medium supplied with kinetin (2 mg/l)  and NAA (0.5 mg/l).     The  seeds  of  brinjal  cv.  Jhumki  were  collected  from  Bangladesh  Agricultural  Research  Institute  (BARI),  Joydebpur, Gazipur and stem, root and leaf were used  for  establishment  of  culture.  Healthy  seeds  of  brinjal  cv.  Jhumki  were  collected  from  the  BARI.  The  seeds  were  then  washed  thoroughly  in  running  tap  water.  The  instruments  like  scalpels,  forceps,  needles  etc.  were  sterilized  inside  the  Laminar  Air  Flow  Cabinet.  Other requirements like petridishes, distilled water and  glassware were sterilized by an autoclave. The surface  sterilization of these seeds was carried out by dipping  Nepal Journal of Biotechnology. Jan. 2011, Vol. 1, No. 1: 49‐54  50  Biotechnology Society of Nepal (BSN), All rights reserved   and flaming method under a Laminar Air Flow Cabinet  and  others  were  rinsed  in  70%  ethyl  alcohol  for  one  minute,  and  then  thoroughly  washed  with  sterilized  distilled  water.  The  alcohol  treated  seeds  were  sterilized  with  0.1%  HgCl2  solution  for  8‐10  minutes,  few drops Tween‐20 per 100 ml was also added at that  time.  The  seeds  were  then  washed  5‐6  times  with  sterilized distilled water. The seeds were then ready for  placement into the media. Sterilized seeds were placed  into  seed  germination  medium  in  Petridish.  Six  seeds  were  placed  in  each  Petridish.  The  culture  was  then  incubated  in dark till the germination of seeds. These  were  then  transferred  to  16  hours  light  for  normal  seedling growth. MS (Murashige & Skoog, 1962) basal  medium  with  different  concentrations  and  combinations of BAP (0, 2.0, 3.0 and 4.0 mg/l) and NAA  (0,  0.1,  0.5  and  1.0  mg/l)  were  used.  Six  pieces  (2‐3  mm) of stem segments were arranged horizontally on  each petridish  and  gently pressed  into  the  surface  of  the  sterilized  culture  medium  with  various  concentrations  and  combinations  of  hormones  like  NAA  and  BAP.  The  petridish  was  covered  and  sealed  with  Para  film.  Leaf  segment  from  each  germinated  seedling  were  cut  into  small  pieces  using  sterilized  scalpel under a Laminar Air Flow Cabinet. Six pieces of  leaf  segments  were  arranged  on  each  petridish  and  gently pressed into the surface of the sterilized culture  medium.  The  Petri  dishes  were  covered  and  sealed  with Para film. Root tip segments (0.5mm) were placed  on  a  sterilized  petridish  under  a  Laminar  Air  Flow  Cabinet.  The  petridish  was  covered  and  sealed  with  Para film.  Plant regeneration from induced calli of brinjal through  MS  medium  supplemented  with  different  combinations of hormones was used. Stem,  leaf, root  segments  were  used  as  explants  to  observe  their  callusing response. Thirty explants were  inoculated  in  each  treatment.  Among  the  explants  used,  stem  was  comparatively  more  responsive  for  callus  induction  than other explants. The combined effect of explants  and different combinations of BAP and NAA on callus  induction has been presented in Table 1.Stem showed  the  highest  callusing  mean  (8.363)  whereas  leaf  segments  gave  callusing  mean  (6.950)  and  root  segments had the  lowest callusing mean (6.688). The  highest callusing was obtained in 2.0 mg/l BAP (8.567)  and 0.5 mg/l NAA (9.333). Also minimum days (9.725)  were  required  for  callus  induction  from  stem.  Days  required for callus  induction from 2.0 mg/l BAP were  10.350 and days required for callus induction from 0.5  mg/l were 10.367. In case of stem, among the different  combination  of  MS  media  containing  2.0  mg/l  BAP  +  0.5 mg/l NAA and 4.0 mg/l BAP + 0.5 mg/l NAA showed  better  callus  induction  i.e.  14.600  and  11.600  respectively  out  of  30  cultured  explants  in  Fig.  2  and  Fig.  3.  On  the  other  hand,  in  case  of  leaf  the  combination of 2.0 mg/l BAP + 0.5 mg/l NAA showed  better callus induction i.e. 13.4. The explants cultured  on MS medium without hormones did not produce any  callus.  It  was  also  found  that  calli  were  induced  in  medium supplemented with BAP and NAA which  is  in  support  of  the  results  obtained  by  Jayasree  et  al.  (2001). The percentage of callus induction was highest  in MS media containing 2.0 mg/l BAP + 0.5 mg/l NAA  from stem i.e. 48.666% followed by callus induction in  Figure 1: Seed germination from brinjal cv. Jhumki on  MS media without  hormones at 7 days   Figure 2. Callus induction from brinjal cv. Jhumki on MS  media with hormones (BAP and NAA) at 22 days   Nepal Journal of Biotechnology. Jan. 2011, Vol. 1, No. 1: 49‐54  51  Biotechnology Society of Nepal (BSN), All rights reserved   Explants  were  cultured  on  MS  media  supplemented  with different combinations and concentrations of BAP  (0, 2.0, 3.0 and 4.0 mg/l) and NAA (0, 0.1, 0.5, and 1.0  mg/l).  The  highest  amount  of  callus  (48.66%)  was  produced on MS medium containing 2.0 mg/l BAP and  0.5  mg/l  NAA  from  stem  and  8.2  days  required  for  callus formation. The growth of callus was faster on MS  media supplemented with 2.0 mg/l BAP and 0.5 mg/l  NAA  from  the  stem.    Maximum  number  of  plant  regeneration through callus from stem containing 2.0  mg/l  BAP  and  0.5  mg/l  NAA  were  3.4  (23.287%)  and  from  leaf  containing  2.0  mg/l  BAP  and  0.5  mg/l  NAA  were 1.6 (11.94%).  Acknowledgement  All  praises  are  due  to  Almighty  God  ,for  bestowing  mercy upon me and for imbibing confidence on me to  materialize  the  research  work  .The  author  deem  it  a  proud  privilege  to  express  his  deep  gratitude,  over  indebtedness  sincere  appreciation  to  his  reverend  teacher  and  supervisor  Foreign  professor  Dr.  Lutful  Hassan,  Dept.  of  Genetics  &  Plant  Breeding  ,Bangladesh  Agricultural  University  ,  Mymensingh  for  his  constant  supervision,  untiring  assistance  ,  scholastic  ,continuous  impression  and  constructive comments. The authors also wish to thank  USDA  project  for  providing  fund.  This  paper  is  supported  by  Bangladesh  Association  for  Biotechnology (BABT).   leaf. The combination of 2.0 mg/l BAP + 0.5 mg/l NAA  required  8.2  days  for  callus  induction  from  stem  explants.  On  the  otherhand,  the  combination  of  2.0  mg/l BAP + 0.1 mg/l NAA needed 10.8 days for callus  from  root  explants.  So,  callus  induction  from  stem  required minimum days. Among the supplements, the  highest  regeneration  potentiality  observed  from  2.0  mg/l BAP (0.717) and 0.5 mg/l NAA (0.667). But there  was  no  regeneration  ability  without  hormones.  The  combined effect of different combinations of BAP and  NAA in MS medium on plant regeneration from stem,  leaf and root of brinjal cv. Jhumki have been presented  in  Table  2.  Various  combinations  of  supplements  showed  significant  variation  in  regeneration  ability.  Among the used combinations, 2.0 mg/l BAP + 0.5 mg/l  NAA showed the highest regeneration of plantlets from  stem  (3.400).  The  regeneration  of  plantlets  was  (1.6)  from  leaf  in  2.0  mg/l  BAP  and  0.5  mg/l  NAA  combinations.  Root  showed  lowest  regeneration.  The  percentage(i.e. 23.28%) of regeneration was recorded  the highest in MS media containing 2.0 mg/l BAP + 0.5  mg/l  NAA  from  stem  and  days  required  for  regeneration  was  minimum  (38.8  days).  The  percentage  (11.94%)  of  regeneration  was  the  highest  in 2.0 mg/l BAP + 0.5 mg/l NAA from leaf. i.e. 1.6 and  percentage  of  regeneration  from  root  is  the  lowest.  Plant regeneration from leaf in 2.0 mg/l BAP + 0.5 mg/l  NAA combination required minimum days (46.2 days).  From  the  above  discussion,  we  found  that  the  best  shoot  regeneration  was  recorded  from  media  supplemented with 2.0 mg/l BAP + 0.5 mg/l NAA in Fig.  4.  Figure 3. Callus induction from brinjal cv. Jhumki on MS  media with hormones (BAP and NAA) at 22 days.   Figure 4. Direct regeneration from brinjal cv. Jhumki on  MS medium supplemented with 2.0 mg/l BAP + 0.5 mg/l  NAA   Nepal Journal of Biotechnology. Jan. 2011, Vol. 1, No. 1: 49‐54  52  Biotechnology Society of Nepal (BSN), All rights reserved   Treatment combinations  No. of explant showing  callus induction  % of callus induction  Days required for callus  induction Explants  Treatments  BAP (mg/l)  NAA (mg/l)     Stem  0  0  0.000 R  0.000 R  0.000I  0.1  7.000 JKLMN  23.333 JKLMN  10.400 ABCDEF  0.5  6.600 KLMNO  22.000 KLMNO  10.44 ABCDEF  1.0  7.400 HIJKLM    24.066 HIJKIM  10.600 ABCDEF  2.0  0  6.200 LMNO  20.660 LMNO  10.400 ABCDEF  0.1  8.600 FGHI  28.666 FGHI  9.600 EBCDEFG  0.5  14.600 A  48.666 A  8.200 GH  1.0  9.600 DEFG  32.000 DEFG  9.600 EFG  3.0  0  6.800 KLMNO  22.660 KLMNO  11.200 ABCDE  0.1  9.400 DEFG  31.330 DEFG  10.800 ABCDE  0.5  10.200 DE  34.000 DE  9.800 DEFG  1.0  9.200 DEFG  30.666 DEFG  10.600 ABCDEF  4.0  0  6.600 KLMNO  22.000 KLMNO  11.400 ABCDE  0.1  10.000 DEF  33.333 DEF  11.200 ABCDE  0.5  11.600 C  38.666 C  10.000 CDEF\G  1.0  10.000 DEF  33.333 DEF  11.400 ABCDE     Leaf  0  0  0.000 R  0.000 R  0.000 ABCDE  0.1  5.800 NOP  19.333 NOP  11.000 ABCDE  0.5  6.000 MNO  20.000 MNO  10.800 ABCDE  1.0  9.200 DEFG  30.666 DEFG  10.600 ABCDF  2.0  0  4.600 PQ  15.330 PQ  11.000 ABCDE  0.1  7.400 IJKLM  24.660 IJKLM  10.200 BCDEF  0.5  13.400 B  44.660 B  8.600 FH  1.0  9.800 DEF  32.666 DEF  10.800 ABCDE  3.0  0  4.400 Q  14.666 Q  10.800 ABCDE  0.1  6.400 KLMNO  21.333 KLMNO  10.800 ABCDE  0.5  6.200 LMNO  20.660 LMNO  11.200 ABCDE  1.0  10.000 DEF  33.333 DEF  10.800 ABCDE  4.0  0  4.400 Q  14.666 Q  11.400 ABCDE  0.1  7.600 HIJK  25.333 HIJK  11.600 ABCDE  0.5  7.400 IJKLM  24.661 IJKLM  11.600 ABCDE  1.0  8.600 FGHI  28.660 FGHI  11.200 ABCDE     Root  0  0  0.000 R  0.000 R  0.000 I  0.1  4.400 Q  14.666 Q  12.200 AB  0.5  6.400 KLMNO  21.333 KLMNO  12.400 A  1.0  6.600 KLMNO  22.000 KLMNO  11.800 ABCD  2.0  0  4.200 Q  14.000 Q  12.000 ABC  0.1  6.600 KLMNO  22.000 KLMNO  11.400 ABCDE  0.5  9.600 DEFG  32.000 DEFG  10.800 ABCDE  1.0  8.200 GHIJ  27.330 GHIJ  11.600 ABCDE  3.0  0  5.400 OPQ  18.000 PQ  11.400 ABCDE  0.1  7.800 HIJK  26.000 HIJK  11.000 ABCDE  0.5  10.600 CD  35.330 CD  10.200 BCDEF  1.0  8.800 EFGH  29.330 EFGH  11.600 ABCDE  4.0  0  4.400 Q  14.666 Q  7.600 H  0.1  6.800 JKLMNO  22.660 JKLMNO  11.800 ABCD  0.5  9.400 DEFG  31.330 DEFG  10.400 ABCDEF  1.0  7.800 HIJK  26.00 HIJK  11.400 ABCDE  Table 1. The effect of BAP and NAA in MS medium on callus induction from different explants.  Nepal Journal of Biotechnology. Jan. 2011, Vol. 1, No. 1: 49‐54  53  Biotechnology Society of Nepal (BSN), All rights reserved   Table 2. The effect of BAP and NAA in MS medium on plant regeneration from different explants.   Treatment combinations  No. of plants regenerated through  callus  % of regeneration  Days required for regeneration  Explants  BAP (mg/l)  NAA (mg/l)  Stem  0  0  ‐  ‐  ‐  0.1  ‐  ‐  ‐  0.5  ‐  ‐  ‐  1  ‐  ‐  ‐  2  0  0.200 CD  3.222 CD  39.200 G  0.1  0.600 CD  6.976 CD  39.800 G  0.5  3.400 A  23.287 A  38.800 G  1  0.600 CD  6.25 CD  39.000 G  3  0  0.200 CD  2.94 CD  39.400 G  0.1  0.800 C  8.510 C  39.800 G  0.5  0.800 C  7.843 C  39.800 G  1  0.600 CD  6.521 CD  39.600 G  4  0  0.400 CD  6.060 CD  40.000 G  0.1  0.600 CD  6.000 CD  40.000 G  0.5  0.400 CD  3.448 CD  39.800 G  1  0.400 CD  4.00 CD  39.600 G  Leaf  0  0  ‐  ‐  ‐  0.1  ‐  ‐  ‐  0.5  ‐  ‐  ‐  1  ‐  ‐  ‐  2  0  0.400 CD  8.695 CD  48.800 CD  0.1  0.600 CD  8.108 CD  48.000 DE  0.5  1.600 B  11.940 B  46.200 F  1  0.600 CD  6.122 CD  49.000 CD  3  0  0.400 CD  9.090 CD  48.800 CD  0.1  0.400 CD  6.25 CD  48.400 CDE  0.5  0.600 CD  9.677 CD  47.400 E  1  0.400 CD  4.00 CD  48.200CDE  4  0  0.200 CD  4.545 CD  49.000 CD  0.1  0.400 CD  5.361 CD  49.000 BC  0.5  0.400 CD  5.405 CD  50.200 C  1  0.400 CD  4.651 CD  49.200 BC  Root  0  0  ‐  ‐  ‐  0.1  ‐  ‐  ‐  0.5  ‐  ‐  ‐  1  ‐  ‐  ‐  2  0  ‐  ‐  ‐  0.1  ‐  ‐  ‐  0.5  0.200 CD  2.083 CD  60.200 A  1  0.200 CD  2.439 CD  60.000 A  3  0  ‐  ‐  ‐  0.1  0.200 CD  2.564 CD  59.600 A  0.5  0.400 CD  5.128 CD  59.800 A  1  0.200 CD  2.272 CD  59.600 A  4  0  ‐  ‐  ‐  0.1  0.200 CD  2.947 CD  60.400 A  0.5  0.200 CD  2.127 CD  59.400 A  1  0.400 CD  5.128 CD  60.000 A  Nepal Journal of Biotechnology. Jan. 2011, Vol. 1, No. 1: 49‐54  54  Biotechnology Society of Nepal (BSN), All rights reserved   References  Anwar, S; D. Sabana; S. A. Siddiqui; A. Shahzad and S.  Din. (2002). Clonal     Propagation of brinjal, Solanum  melongena,  through  young  petiolated  leaf  culture.  Bionotesx, 4(3): 61.  BBS.2003.  Statistical  Yearbook  of  Bangladesh.  Bangladesh Bureau of Statistics. Ministry of Planning,  Government of the people’s Republic of Bangladesh.    Dhaka, Bangladesh. p. 150.  Jayasree,  T.;  V.  Paban  ;  M.  Ramesh;  A.V.  Rao  and  K.  J.M. Reddy. (2001). Somatic Embryogenesis from leaf  cultures of potato. Plant Cell Tissue Organ Cult., 64 (1):  13‐17.  Murashige, T. and F. Skoog. (1962). A revised medium  for rapid growth and Bioassays with tobacco  tissue  cultures. Physiol. Plant., 15: 473‐497.  Zeven, A. C. and P. M. Zhukovsky.(1975). Dictionary of  cultivated  plants  and  their  Centre  of  Diversity.  Wageningen, Netherlands.p. 219