4 Nepal Journal of Biotechnology. Jan. 2011, Vol. 1, No. 1: 22‐30  22  Biotechnology Society of Nepal (BSN), All rights reserved   ORIGINAL RESEARCH ARTICLE  Development of PCR assay for targeting partial lipL21  and lipL41 gene of leptospira  S. Chandan1, S. Umesha1, S.K. Bhure2, N. Haraprasad3, S. Chandrashekar1  1 Department of Studies in Biotechnology, University of Mysore, Manasagangotri, Mysore‐570006, Karnataka, India. 2 IVRI, Izatnagar, Bareilly‐243  122, Uttar Pradesh, India. 3 Department of Biotechnology, SJ College of Engineering, Manasagangotri, Mysore‐570006, Karnataka, India.  Abstract  Leptospirosis is a bacterial zoonotic disease caused by spirochetes of the genus Leptospira that affects human  and a wide range of animals. The direct method of diagnosis of leptospirosis, has been so far by culture isolation  but it is time consuming and potentially biohazardous. Another traditional method is the detection of antibodies  (Serological  tests)  which  is  also  a  time  consuming  method  and  fails  to  identify  the  infecting  serovar.  To  overcome  these  limitations  associated  with  the  cultivation  and  serology,  we  developed  PCR  assay  targeting  partial lipL21 gene and lipL41 gene of Leptospires using in‐house designed P28/29 and P30/31 primers, with a  product size of 385bp and 427bp. The amplicons were subjected to restriction enzyme digestion using RsaI, Pvu  II and HindIII for product of P28/29 and ClaI, TaqI and RsaI were used for product of P30/31. The protocols were  standardized  and  the  assay  targeting  the  partial  lipL21  and  lipL41  gene  was  found  to  be  specific  for  eight  pathogenic Leptospires out of nine leptospires tested. The products were then cloned in pGEMT Easy vector and  sequenced to facilitate further studies.  PCR could detect the target bacterial gene without any ambiguity and  showed  good  efficiency  in  detection  of  targeted  species  in  the  sample.  This  simple,  rapid  and  cost‐effective  method can be applicable in a prediction system to prevent disease outbreak by these Leptospira species and  can be considered as an effective tool for disease diagnosis of Leptospira species.    Key words: PCR, lipL21, lipL41, Molecular Diagnostics, Transformation.     Correspondence Author:   Sharanaiah Umesha, DOS in Biotechnology, University of Mysore, Karnataka, India.  E‐mail: umeshgroup@yahoo.co.in  Introduction  The  economic  importance  of  bovine  leptospirosis  includes  loss due to abortion,  loss of milk production  and  elevated  veterinary  costs  and  predominantly  human  infection  (Levett  et  al.,  2005).    Leptospirosis  also known as Weil's disease, canicola fever, canefield  fever, nanukayami fever, 7‐day fever and many more.   Leptospirosis recognized as one of the most common  zoonoses.  Leptospirosis  is  commonly  transmitted  to  humans through contact of animal urine with unhealed  breaks  in  the  skin,  eyes  or  with  the  mucous  membranes. Outside tropical areas, leptospirosis cases  have a relatively distinct seasonality with most of them  occurring during August‐September/February‐March in   year (Zhang et al., 1992).   The spectrum of human disease caused by leptospires  is extremely wide, ranging from subclinical infection to  a  severe  syndrome  of  multi  organ  infection  resulting  high mortality. This syndrome, icteric leptospirosis with  renal  failure,  was  first  reported  more  than  100  years  ago  by  Adolf  Weil  in  Heidelberg.  However,  an  apparently  identical  syndrome  occurring  in  sewer  workers  was  described  several  years  earlier.  Earlier  descriptions  of  diseases  that  were  probably  leptospirosis  were  reviewed  recently  (Serres  et  al.,  1995).  Leptospira (from the Greek word leptos means fine or  thin and Latin word spira means saprophytic species).  Leptospira was first observed  in 1907  in kidney tissue  slices of a leptospirosis victim who was reported to die  of “yellow fever” (Abdollahpour, 1990).      The direct  Nepal Journal of Biotechnology. Jan. 2011, Vol. 1, No. 1: 22‐30  23  Biotechnology Society of Nepal (BSN), All rights reserved   in  artificial  medium,  with  Leptospira  present  in  an  infected  animal.  Several  leptospiral  outer  membrane  proteins  have  been  shown  to  attach  to  the  host  extracellular matrix  and  to  factor H,  suggesting  these  proteins may be important for adhesion of Leptospira  to  host  tissues  and  in  resisting  complement,  respectively.  The  outer  membrane  of  Leptospira,  like  those of most other Gram‐negative bacteria, contains  lipopolysaccharide  (LPS).  Differences  in  the  highly  immunogenic LPS structure account for the numerous  serovars  of  Leptospira.  Consequently,  immunity  is  serovar  specific;  current  leptospiral  vaccines,  which  consist  of  one  or  several  serovars  of  Leptospira  endemic  in  the  population  to  be  immunized,  protect  only  against  the  serovars  contained  in  the  vaccine  preparation. Leptospiral LPS has low endotoxin activity.   An unusual feature of leptospiral LPS is that it activates  host  cells  via  TLR2  rather  than  TLR4.    The  unique  structure  of  the  lipid  A  portion  of  the  LPS  molecule  may  account  for  this  observation.  Finally,  the  LPS  O  antigen content of L.  interrogans differs  in an acutely  infected versus a chronically infected animal.  The role  of  O  antigen  changes  in  the  establishment  or  maintenance  of  acute  or  chronic  infection,  if  any,  is  unknown  (Zhang  et  al,.  1992;  Bharti  et  al.,  2003).  Leptospires  enter  into  the  body  of  a  susceptible  host  through mucous membrane or abraded skin.   After 4  to 10 days, the host becomes bacteraemic, this period  lasting from hours to 7 days, and may be characterised  by pyrexia and anorexia (Abdollahpour, 1990).   Materials and Methods  Leptospira  Serovars.  A  total  of  9  Leptospira  serovars  namely,  L.  icterohaemorrhagiae,  L.  canicola,  L.  pamona,  L.  autumnalis,  L.  javanica,  L.  pyrogenes,  L.  australis,  L.  hardjo  and  L.  inadai  were  procured  from  the  repository  of  PD_ADMAS(Project  Directorate  on  Animal  Disease  Monitoring  and  surveillance),  UAS,  Bangalore, India.   Cultivation  of  Leptospira.  Leptospira  serovars  mentioned above were grown in Luria‐Bertani (LB) agar  (Difco Detroit, MI, USA) supplemented with 1‐3% NaCl  at 370C overnight.  DNA  Preparation.  Template  Genomic  DNA  was  extracted/isolated from pure culture of corresponding  Leptospires,  using  QIAamp  DNA  minikit  (QIAGEN,  Germany) and other alternative method described by     Hoshino  et  al.,  1998.  For  it    freshly  grown  bacterial  method for diagnosis of leptospirosis, has been so far  by  culture  isolation  but  it  is  time  consuming  and  potentially  hazardous.    Another  traditional  method  is  the detection of antibodies (serological tests) which is  also a time consuming method and fails to identify the  infecting  serovar.    Classification  and  identification  of  Leptospires  using  serology  is  a  difficult  and  tedious  procedure.    Recently  molecular  biology  techniques  have been introduced for detection.  These techniques  are predominantly used for facilitating the study of the  epidemiology  of  leptospirosis.    Genetic  taxonomy  involves  DNA/DNA  hybridisation  and  GC  content  the  guanine‐plus‐cytosine  mol  percentages  (G+C  mol  %)  content of DNA. The genotypic classification based on  DNA  hybridization  defined  21  genome  species  of  Leptospira  that  include  29  serogroups  and  269  serovars.  Yasuda  et  al.,  1987  proposed  a  new  classification  of  Leptospira  based  on    DNA  homology  study on 46 pathogenic and non pathogenic serovars.  Woodward  and  Redstone,  1994  developed  a  polymerase  chain  reaction  (PCR)  combined  with  restriction  fragment  length  polymorphism  which  can  be used for differentiation of leptospira serovars.  It is  suggested  that  the  PCR  combined  with  restriction  fragment length polymorphism is useful tool for rapid  detection  and  preliminary  differentiation  of  Leptospires (Levett et al., 2001).  Although  over  269  serovars  of  Leptospira  have  been  described,  all  members  of  the  genus  have  similar  morphology. Leptospira are spiral‐shaped bacteria that  are 6‐20 μm long and 0.1 μm in diameter.  One or both  ends  of  the  spirochete  are  usually  hooked.  Because  they are so thin,  live Leptospira are best observed by  dark field microscopy. The bacteria have a number of  freedom degrees; when ready to proliferate via binary  fission, the bacterium noticeably bends in the place of  the future split (Levett et al., 2005). Leptospira have a  Gram‐negative‐like  cell  envelope  consisting  of  a  cytoplasmic  and  outer  membrane.  However,  the  peptidoglycan layer is associated with the cytoplasmic  rather than the outer membrane, an arrangement that  is unique to spirochetes. The two flagella of Leptospira  extend from the cytoplasmic membrane at the ends of  the  bacteria  into  the  periplasmic  space  and  are  necessary  for  the  motility  of  Leptospira.  The  outer  membrane  contains  a  variety  of  lipoproteins  and  transmembrane  outer  membrane  proteins.  As  expected,  the  protein  composition  of  the  outer  membrane differs when comparing Leptospira growing  Nepal Journal of Biotechnology. Jan. 2011, Vol. 1, No. 1: 22‐30  24  Biotechnology Society of Nepal (BSN), All rights reserved   step at 720C for 1 min and a final elongation at 720C for  5 min. Finally annealing temperature was standardized  to 600C for 1 min (Fig. 1a).   The  PCR  standardization  using  primers  P30/31  was  initiated in a 25 ml reaction volume containing 10x Taq  buffer  with  KCl  (100mM  Tris  HCl,  50mM  KCl,  0.8% Nonidet P40), 1.5mM MgCl2, 2.5mM of each dNTPs, 2U  of  Taq  polymerase,  25pmoles  of  each  primer  and  0.25ml of DNA (40ng/ml) extract from L. javanica. The  test  was  done  for  several  combinations  annealing  temperatures from 550C to 650C. The reaction started  with an initial denaturation temperature of 950C for 5  min followed 35 cycles of denaturing at 950C for 1 min,  annealing at 600C for 1 min at G ± 50C, elongation step  at 720C for 45 sec and a final elongation at 720C for 5  min.  Finally  annealing  temperature  was  standardized  to  600C  for  1  min  (Fig.  1b).    Optimized  annealing  temperature details shown in table (Table 2).  Agarose  gel  electrophoresis.  A  15  ml  aliquot  of  each  PCR  product  was  mixed  with  3µl  of  6x  loading  dye  (Fermentas) and loaded on to the wells of 2% agarose  gel in TAE buffer. It was run at 80V for about 45 min.  DNA bands were visualized under UV‐Trans illuminator  and documented using gel documentation system with  Quantity  one  software  (Biorad,  U.S.A)  and  the  PCR  product  was  eluted  using  eppendorf  QIAquick  gel  extraction kit (QIAGEN, Germany).  colonies were suspended in 500 µl TE buffer or 50µl of  mid‐log phase bacterial culture was added to 450µl of  TE buffer, then the cell suspension was boiled for 10  min  followed  by  quick  cooling  on  ice  for  5  min,  and  centrifuged  at  12,800  g  for  5  min.    The  supernatant  was collected and stored at ‐300C until use.  Primer  Design.  All  available  sequences  of  the  target  genes  among  Leptospira  spp.  were  downloaded  from  the  GenBank  (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank/ GenBankSearch.html). PerlPrimer software by Marshall  et al., (2004) was used to design the primers. Sequence  for  LipL21  holding  accession  number  AY688426  and  lipL41  sequence  of  Leptospira  borgpetersenii  serovar  Hardjo‐bovis  holding  accession  number  CP000348.1  was retrieved from NCBI‐Genbank.  It was then used to  get  conserved  sequences.  The  conserved  part  of  the  nucleotide sequence was retrieved and used for primer  designing. The criteria that was set for primer design  was primer length is 20±2 Target temperature is 55±1° C.    The  overall  theoretical  specificities  of  the  newly  designed  primers  were  checked  using  BLAST  search.   Details  of  the  primers’  sequences,  their  expected  amplicons sizes after PCR, etc. are summarized in table  (Table 1).  Standardization  of  polymerase  chain  reaction  (PCR)  protocol. In order to achieve the best sensitivity for the  PCR  using  primer  P28/29  several  combinations  of  annealing  temperatures  from  580C  to  680C  were  tested. The following conditions were chosen: PCR was  performed  in  25  ml  reaction  volume  containing  10x  Taq buffer with KCl (100mM Tris HCl, 50mM KCl, 0.8%  Nonidet P40), 1.5mM MgCl2, 2.5mM of each dNTPs, 2U  of  Taq  polymerase,  25pmoles  of  each  primer  and  0.25ml  of  DNA  (40ng/ml)  extract  from  L.  icterohaemorrhagiae.  PCR  chemicals  were  procured  from Fermantas. The reactions were carried out in an  Eppendorf thermocycler. Initially, PCR conditions were  optimized  by gradient  PCR.  The  reaction  started  with  an  initial  polymerase  activating  temperature  of  950C  for 5 min followed 35 cycles of denaturing at 950C for 1  min, annealing at 630C for 1 min at G ± 50C, elongation  Primer  Target species/gene  Sequence(5’‐3’)  Amplicon Length  Reference (Accession  no.)  P28/F  Leptospira/LipL21  CCAGCACTGACACCGGACAAA  385bp  AY688426  P29/R  Leptospira/LipL21  CCGGAACCAACCGCTTTACAT  385bp  AY688426  P30/F  Leptospira/LipL41  GACCTCAGTAAACGCGCCGATAT  427bp  CP000348.1  P31/R  Leptospira/LipL41  CAGCGGCTTCGTCCAATCCT  427bp  CP000348.1  Table 1. Details of the newly designed primers for specific identification     PCR reaction mixture(25ml)     P28 /P29     P30/P31     10X buffer                         2.50ml  MgCl2                                                  1.50ml  dNTPs                                                  2.00ml  Primer‐Forward                        0.50ml  Primer‐Reverse                         0.50ml  Template                                          0.25ml  Taq Pol                                    2.00ml  Nuclease   free water     15.75µl  Table 2. Details of Standardized thermal cycling  condition   Nepal Journal of Biotechnology. Jan. 2011, Vol. 1, No. 1: 22‐30  25  Biotechnology Society of Nepal (BSN), All rights reserved   min. Immediately mixture  was kept over ice for 2min.   0.8ml of LB broth was then added to it and incubated  at  37°C  for  90  min  in  an  orbital  shaker.    It  was  then  centrifuged at 4000 rpm for 10 min and the pellet was  plated on LB agar plate containing ampicillin (50mg/ml)  and  40ml  of  2%  X‐gal  (5‐bromo‐4‐chloro‐3‐indolyl‐b‐ galactopyranoside) and 8ml of 2% IPTG (Isopropyl‐b‐D– thiogalactopyranoside).  The  plates  were  then  incubated over night at 37°C.  Well‐isolated  white  colonies  (Fig.  4)  were  picked  and  transferred  to  5ml  of  LB  broth  containing  5ml  of  ampicillin (50mg/ml).  The tubes were then incubated  at  37°C  in  the  shaker  for  overnight.  Plasmid  DNA  isolation and purification was done using QIAprep spin  miniprep kit (Qiagen, Germany) and microcentrifuge.  Characterization  of  Recombinants.  The  plasmids  isolated  from  the  white  colonies  were  further  characterized by the insert release after digestion with  EcoRI  (G  ˉAATTC)  restriction  enzyme.  The  enzyme  EcoRI was used to cleave and release the insert in the  plasmid  (Fig.  5a  and  5b).  The  reaction  mixtures  were  prepared as per the table below and were subjected to  digestion at 37°C in a water bath for 1h.  Details of the  reaction mixture are summarized in table (Table 5).  PCR  for  Confirmation.  The  PCR  were  carried  out  for  confirmation of the recombinants using primer P28/29  and  P30/31  under  the  standardized  conditions  as  described  previously  using  the  plasmid  DNA  as  template. It was performed in a 25 ml reaction volume  containing  10x  buffer  (100mM  Tris  HCl,  50mM  KCl,  0.8%Nonidet  P40),  1.5mM  MgCl2,  2.5mM  of  each  dNTPs, 2U of Taq polymerase, 25pmoles each primer  and 1ml of template (1:10 diluted).     5ml  aliquot  of  PCR  products  mixed  with  1µl  of  6x  loading dye (Fermentas) and loaded on to the wells of  2.5% agarose gel. It was run at 80V for about 45 min.  DNA bands were visualized under UV‐Transilluminator  and  documented  using  Biorad  gel  documentation  system with Quantity one software (Fig. 6a and 6b).   Characterization  of  amplicons.  The  PCR  product  of  primer  P28/29  and  primer  P30/31  were  subjected  to  RE  digestion.  The  enzymes  RsaI(GTˉAC)  and  HindIII (AˉAGCTT)  were  used  to  characterize  PCR  product  of  P28/29  (Fig.  2a)  and  enzymes  ClaI(ATˉCGAT),  TaqI (TˉCGA)  and  RsaI(GTˉAC)  were  used  to  characterize  PCR product of P30/31 (Fig. 2b).   The reactions were  set as under and incubated at 37°C in a water bath for  4h.  Restriction  enzymes  and  its  corresponding  buffer  were  procured  from  Fermentas.    ClaI  and  its  corresponding  buffer  were  procured  from  Promega.   Details  of  the  reaction  mixture  are  summarized  in  Table 3.   A 15 ml aliquot of each digested products were mixed  with 3µl of 6x loading dye (Fermentas) and loaded on  to the wells of 2% agarose gel in TAE buffer. It was run  at  80V  for  about  45  min.  DNA  bands  were  visualized  under UV‐Transi lluminator and documented using gel  documentation  system  with  Quantity  one  software (Biorad, U.S.A) (Fig. 2a and 2b).  Specificity  the  PCR  Assay.  The  specificity  of  both  the  assay developed was tested by taking 10‐20ng of each  template DNA isolated from the different serovars and  the  PCR  was  carried  out  under  the  standardized  conditions as shown in table (Table 4).  A 10ml aliquot of each PCR product mixed with 2ml of  6x loading dye (Fermentas) was run on a 2.5% agarose  electrophoretic gel in TAE buffer and DNA bands were  visualized under UV‐Transilluminator and documented  using  gel  documentation  system  with  Quantity  one  software (Biorad, U.S.A) (Fig. 3a and 3b).  Transformation.  Ligation  mixture  was  prepared  by  adding 1ml of pGEMT Easy (50ng) vector at the rate of  and 1ml of T4 DNA ligase (3U/ml) to 5ml of 2x buffer.  5ml  of  DNA  (50ng/ml)  was  added  to  this  mixture  for  ligation. Ligation was done at 4°C for overnight.  Ligation  mixture  was  added  to  ice  cold  200ml  of  competent cells and tapped gently, it was incubated on  ice for 30 min., then Heat shock was given at 42°C for 1  Reaction  Mixture  LipL21  LipL41  RsaI  HindIII  ClaI  TaqI  RsaI  Buffer  Enzyme  DNA  Water  BSA  2.0 ml  1.0 ml  8.0  ml  11.0 ml  ‐  2.0 ml  1.0 ml  8.0 ml  11.0 ml  ‐‐‐‐‐‐  2.0ml  1.0ml  5.0ml  10.0ml  2.0ml  2.0ml  1.0ml  5.0ml  12.0ml  ‐  2.0ml  1.0ml  5.0ml  12.0ml  ‐  Table 3. Details of the Restriction Enzyme  digestion reaction of LipL21 and LipL41   Nepal Journal of Biotechnology. Jan. 2011, Vol. 1, No. 1: 22‐30  26  Biotechnology Society of Nepal (BSN), All rights reserved   out  reactions  at  various  annealing  temperatures  ranging from 58°C to 68°C on L.  icterohaemorrhagiae  serovar. This showed non‐specific amplification at 58° C,  58.7°C,  60.8°C  and  63.5°C.  So  PCR  reaction  using  P30/31 was carried out on L.javanica template at two  different MgCl2 concentration i.e. (0.5, 1.0µl). No bands  could be detected for PCR amplification at 0.5 µl MgCl2  but  specific  band  of  430bp  was  observed  at  1.0  µl  MgCl2.    Standardization  was  done  by  carrying  out  reactions at various annealing temperatures from 55°  to  65°C  for  1  min.  Good  amplification  bands  were  observed  for  PCR  reactions  carried  out  at  annealing  temperatures  60.5°C,  61.8°C,  63.1°C,  64.2°C,  65.0°C  and 65.5°C (Fig. 1b).  The 427bp amplicons thus amplified was subjected to  RE.  The  restriction  enzyme  pattern  of  this  amplicon  confirms  it  to  be  a  lipL41  partial  gene  of  leptospira  genus (Fig. 2b).  The  specificity  of  this  primer  was  tested  on  nine  different serovars under optimized conditions. The PCR  assay showed nonspecific amplification along with the  specific  band.  Primer  degradation  was  suspected  and  the  PCR  reactions  at  the  optimized  conditions  were  repeated with fresh primer set P30/31. PCR reactions  were  again  carried  out  on  nine  serovars  at  MgCl2  Results and Discussion  Specificity  of  Leptospira  spp.  Primers.  Initially,  PCR  using  P28/29  was  standardized  by  carrying  out  reactions  at  various  annealing  temperatures  ranging  from 58°C to 68°C on L.  icterohaemorrhagiae serovar  which showed amplification at 58°C, 58.7°C and 60.8°C  (Fig.1a).  A  single  band  of  approximately  385bp  was  observed at 60°C annealing temperature. A set of PCR  reactions  were  done  by  varying  the  template  concentration from 5ng to 60ngand could amplify the  specific  band  at  all  the  template  concentrations.  The  PCR  products  were  pooled  and  characterized  by  subjecting  to  RE  digestion  using  RsaI  and  HindIII  restriction  enzymes,  both  of  which  confirmed  the  product  size  of  P28/29  to  be  385bp  (Fig.2a).  The  specificity of this primer was tested on nine different  serovars namely L. icterohaemorrhagiae, L. canicola, L.  pamona,  L.  autumnalis,  L.  javanica,  L.  pyrogenes,  L.  australis,  L.  hardjo  and  L.  inadai  under  standardized  condition. The assay targeting the partial sequence of  lipL21  was  found  to  be  specific  for  eight  pathogenic  Leptospires out of nine  Leptospires tested (Fig. 3a)  For the PCR assay targeted to the partial sequence of  lipL41,  standardization  was  done  initially  by  carrying  Figure  1.  (a)  Specificity  and  detection  of  annealing  temperature of LipL21 gene. Annealing temperature  was  standardized  to  600C  for  1  min.    Lane1‐6,  PCR  products  using  DNA  template  of  L.  icterohaemorrhagiae.    Lane  1‐6  annealing  temperature  of  each  lane  corresponding  to  58oC,  58.7oC,  60.8oC,  63.5oC,  66.1oC,  68oC,  respectively.   Lane  7,  100bp  DNA  ladder  (Fermentas).    Gel  run  performed using 2% agarose.   Figure  1.  (b)  Specificity and detection of annealing  temperature of LipL41 gene. Annealing temperature  was standardized to 600C for 1 min.   Lane2‐7, PCR  products using DNA template of L. javanica.  Lane 2‐ 7 annealing temperature of each lane corresponding  to  60.5oC,  61.8oC,  63.1oC,  64.2oC,  65.0oC,  65.6oC,  respectively.    Lane  1  and  8,  100bp  DNA  ladder  (Fermentas).  Gel run performed using 2% agarose.   Nepal Journal of Biotechnology. Jan. 2011, Vol. 1, No. 1: 22‐30  27  Biotechnology Society of Nepal (BSN), All rights reserved      Organism  PCR reaction mixture (25ml)        P28 /29     P30/31     L. javanica  L. autumnalis  L. hardjo  L. pyrogenes  L. pamona  L. australis  L. icterohaemorrhagiae  L. inadai  L. canicola  10x buffer                      2.50ml  MgCl2                                              1.50ml  dNTP mix                                     2.00ml  Forward Primer                    0.50ml  Reverse Primer                     0.50ml  Template                                      0.25ml  Taq Pol                                2.00ml  Nuclease free water     15.75ml     LipL21  LipL41  Buffer  (10x)  Enzyme  DNA  Water       2.0 ml       1.0 ml       8.0 ml     11.0 ml       2.0 ml       2.0 ml       5.0 ml       10.0 ml         Total     20.0 ml      20.0 ml  Table 4. Details of the standardized conditions for PCR   Table 5. Details of the Restriction  Enzyme digestion reaction for insert  release   Figure  2.  (a)  Characterization  of  Amplicons  using  restriction enzymes RsaI in lane 2 and HindIII in lane  3 and lane DNA template without RE enzyme in lane  1,  lane  4,  100bp  Gene  Ruler.      Gel  run  performed  using 2% agarose.   Figure  2.  (b)  Characterization  of  Amplicons  using  restriction enzymes ClaI  in lane 3, TaqI in lane 3 and  RsaI in lane 5, DNA template with out RE enzyme in  lane  2,  lane  1  and  6,  100bp  Gene  Ruler.    Gel  run   performed using 2% agarose.   concentration  of  1mM.  This  assay  proved  to  be  only  specific  to  L.  javanica  serovar  out  of  nine  serovars  tested (Fig. 3b).  The  PCR  product  of  both  P28/29  and  P30/31  of  size  385bp  and  427bp  respectively  were  then  individually  cloned  into  pGEMT  Easy  TA  cloning  vector  and  transformed  to  JM109  E.  coli  competent  cells  and  plated on LB ampicillin plates with IPTG and X‐gal (Fig.  4). The discrete five white colonies and a blue colony  were then picked, cultured and plasmid was  isolated.  The  recombinants  were  then  characterized  by  releasing  the  insert  (Fig.  5a  and  5b)  using  EcoRI  restriction  enzyme  followed  by  PCR  reaction  (Fig.  6a  and 6b) for confirmation. The cloned sequences were  then  sent  for  sequence  analysis  (MWG  Biotech  Pvt.  Ltd., Bangalore) in order to facilitate further studies.  One of the main advantages of using this technique on  various  biological  samples  is    possibility  to  detect  pathogenic  Leptospires  first  by  PCR  assay  and  subsequently  confirming  it  through  RE  digestion  thus  improving the specificity of the test. Further sequence  analysis may reveal the associated serovar causing the  disease.  The  direct  method  of  diagnosis  of  leptospirosis  is  by  Nepal Journal of Biotechnology. Jan. 2011, Vol. 1, No. 1: 22‐30  28  Biotechnology Society of Nepal (BSN), All rights reserved   culture  isolation,  but  it  is  time  consuming  and  potentially  biohazardous.  Another  traditional  method  is the detection of antibodies (serological tests) but it is  also time consuming and fails to identify the infecting  serovar. To overcome the limitations of cultivation and  serology, we have used PCR amplification of leptospiral  DNA for the diagnosis of leptospirosis at an early stage  of illness.  In  a  previous  study  by  (Merien  et  al.,  1992  and  Gravekamp  et  al,.  1993),  the  16S  rRNA  gene  target  could not differentiate pathogenic and nonpathogenic  Leptospira.    The  development  of  PCR  assay  targeting  partial  sequence  of  lipL21  and  lipL41  gene  of  pathogenic Leptospires using in‐house designed P28/29  and P30/31 primers, with a product size of 385bp and  427bp,  respectively.  These  primers  were  designed  by  using  Gene  Tool  Lite  software.  The  gene  sequence  coding for the respective surface protein was subjected  to  nucleotide  blast  to  get  conserved  sequences.  The  most  conserved  sequence  was  then  chosen  and  primers were designed.  The  newly  developed  PCR  using  in‐house  designed  primers produces expected   amplicons sizes i.e. 385bp  for lipL21 and 427bp for lipL41.  Afterwards when this  PCR  protocol  was  applied  to  examine  all  the  test  samples  of  this  species  also  produces  specific  amplicons.  No amplicons of specific size was observed  in  case  of  non‐target  Leptospira,  or  other  bacterial  Figure 3. (a) The specificity of this primer tested on  nine different serovars under optimized conditions  for lipL21.  Lane 3‐11 different serovars, lane 2, nega‐ tive control and lane 1, 100bp Gene Ruler. Gel run  performed using 2.5% agarose.   Figure 3. (b) The specificity of this primer tested on  nine  different  serovars  under  optimized  conditions  for lipL41.  Lane 2‐5 different serovars and lane 1and  6, 100bp Gene Ruler.  Gel run performed using 2.5%  agarose.   Figure 4.    Plate showing  recombinant  colonies   Nepal Journal of Biotechnology. Jan. 2011, Vol. 1, No. 1: 22‐30  29  Biotechnology Society of Nepal (BSN), All rights reserved   species.  Besides non‐specific amplicon of different size  did not appear in any case.  In conclusion, the assay targeting partial sequence of  LipL41 gene showed high sensitivity and specificity for  L. javanica out of 9 Leptospires tested. The PCR assay  targeting  partial  sequence  of  lipL21  gene,  which  showed  good  sensitivity  and  specificity  with  all  the  nine serovars tested and may also likely to detect other  pathogenic  serovars  as  the  lipL21  sequence  targeted  under the assay is conserved among all the pathogenic  Leptospires  hence  may  be  valuable  tool  for  early  diagnosis  of  pathogenic  Leptospires  directly  from  biological  samples  with  clinical  suspicion  of  leptospirosis.  Figure 5. (a) Insert release of lipL21from recombinant  pGEM‐TE  vector.    Gel  run  performed  using  2.5%  agarose.   Figure 5. (b) Insert release of lipL41 from recombi‐ nant pGEM‐TE vector.  Gel run performed using 2.5%  agarose.   Figure  6.  (a)  PCR  for  lipL21  gene  for  confirmation.   Gel run performed using 2.5% agarose.   Figure  6.  (b)  PCR  for  lipL41  gene  for  confirmation.   Gel run performed using 2.5% agarose.   References  Abdollahpour,  G:  A  review  on  Leptospirosis.   Proceedings of Leptospirosis Research     Conference,  Japan, Matsoyamam ;1990: 34‐37.  Bharti, AR, Nally JE, Ricaldi JN, Matthias MA, Diaz MM:  Leptospirosis:  A  zoonotic  disease  of  global  importance. Lancet Infect Dis 2003, 3:757–771.   Gravekamph C, Kemp VAD, Franzend M, Carrington D,    Schoone GJ,  Eys GJJMV,  Everardr C0R,  Hartskeeraln  RA,  Terpstra  WJ:    Detection  of  seven  species  of  pathogenic  Leptospires  by  PCR  using  two  sets  of  Nepal Journal of Biotechnology. Jan. 2011, Vol. 1, No. 1: 22‐30  30  Biotechnology Society of Nepal (BSN), All rights reserved   primers.  J of Gen Microbiol  1993, 139: 1691‐1700.  Hoshino  K,  Yamasaki  S,  Mukhopadhyaym,  AK,  Chakraborty  S,  Basu  A,  Bhattacharya  SK,  Nair,  GB,  Shimada  T:  Development  and  evaluation  of  a  multiplex PCR assay for rapid detection of toxigenic  Vibrio cholerae O1 and O139.   FEMS  Immunol Med  Microbiol 1998, 20: 201–207.   Levett,  PN,  Songee  L,  Branch,  Carol  U,  Whittington,  Charles  N,  Edwards,    Paxton  H:    Two  Methods  for  Rapid  Serological  Diagnosis  of  Acute  Leptospirosis.  Clin and Diag. Lab Immunology 2001, 8(2):349‐351.  Levett  PN,  Morey  RE,  Galloway  RL,  Turner  DE,  Steigerwalt AG, Mayer LW: Detection of pathogenic  Leptospires  by  real‐time  quantitative  PCR.    J  Med  Microbiol 2005 54(1):45‐49.  Merien  F,  Amouriaux  P,  Perolat  P,  Baranton  G,  Saint  Girons I:  Polymerase Chain Reaction for Detection of  Leptospira  spp.  in  Clinical  Samples.  J  Clin  Microbiol  1992, 30(9):2219‐2224.  Marshall    OJ:  Perl  Primer:  cross‐platform,  graphical  primer design for standard, bisulphite and real‐time  PCR. Bio Inf Applications Note 2004, 20 (15): 2471– 2472.  Serres GD, Levesque B, Higgins R, Major M, Laliberre D,  Bouliance N, Duval B: Need for vaccination of sewer  workers against leptospirosis and hepatitis A.  Occup  and Envt. Med 1995,52: 505‐507.  Woodward    M  J,  Redstone  JS  :  Differentiation  of   leptospira serovars by polymerase chain reaction and  restriction  fragment  length  polymorphism.  Vet  Rec  1993, 132: 325‐326.  Yasuda PH, Arnold G, Steigerwalt, Katherine R, Sulzer,  Arnold F, Kaufmann, Faye Rogers     Don, J, Brenner:  Deoxyribonucleic  Acid  Relatedness  between  Serogroups  and  Serovars  in  the  Family  Leptospiraceae  with  Proposals  for  Seven  New  Leptospira Species.  Int  J  Systc Bact 1987, 37(4): 407 ‐415.  Zhang, Y., Dai, B.  (1992) Detection of Leptospiral DNA  in the serum of 175 patients with early leptospirosis  by polymerase chain reaction.  Hua Xi Yi Ke Da Xue  Xue Bao 23(3):256‐60.