3 Nepal Journal of Biotechnology. Jan. 2011, Vol. 1, No. 1 : 14‐21  14   Biotechnology Society of Nepal (BSN), All rights reserved   ORIGINAL RESEARCH ARTICLE  Analysis of KatG Ser315Thr Mutation in Multidrug Resistant  Mycobacterium tuberculosis and SLC11A1 Polymorphism in  Multidrug Resistance Tuberculosis in Central Development  Region of Nepal Using PCR‐RFLP Technique: A Pilot Study  Raunak Shrestha1, Rubin Narayan Joshi1, Kriti Joshi1, Bal Hari Poudel2 and Bhupal Govinda  Shrestha1  1 Department of Biotechnology, Kathmandu University, Dhulikhel, Nepal.  2 Genetics Nepal Pvt. Ltd., Lalitpur, Nepal.  Abstract  Ser315Thr mutations in genes encoding the mycobacteria catalase‐peroxidase (KatG) has been associated with  the major resistance to isoniazid (INH) in Mycobacterium tuberculosis (MTB). Also G/C polymorphisms in INT4  region of the solute carrier family 11 member 1 gene (SLC11A1) and susceptibility towards tuberculosis (TB) has  been demonstrated worldwide. 24 drug resistant MTB culture positive samples and 24 whole‐blood samples  were collected from different TB patients of Central Development Region of Nepal in 2009. A Polymerase Chain  Reaction (PCR) ‐ Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) assay was carried out in order to investigate  Ser315Thr  KatG  mutation  and G/C  polymorphism  in  INT4  region.  4  (16.67%)  samples  out  of 24  MTB  culture  samples demonstrated the Ser315Thr KatG mutation whereas none of the 24 whole blood samples were found  to  contain  G/C  polymorphism  in  INT4.  Though  no  significant  correlation  could  be  found  between  INT4  polymorphism  and  TB  susceptibility,  overall  scenario  of  Nepal  cannot  be  drawn  from  this  data.  Molecular  diagnostic technique such as PCR‐RFLP can be used  in a robust scale to carry out base  line studies  in the TB  population of Nepal.    Key words: Multi‐drug resistance, Tuberculosis, PCR, RFLP    Correspondence Author:  E‐mail: sraunak@gmail.com  Introduction  During the last decades, incidence of tuberculosis (TB)  has increased in many countries and more people have  the disease now than at any other time in history. It is  estimated that TB still kills more people globally than  any  other  infection  (WHO,  2009).  The  situation  has  worsened  by  the  emergence  of  antibiotic‐resistant  strains of Mycobacterium tuberculosis (MTB) (Musser,  1995). The strains resistant to the two most important  anti‐TB  drugs,  rifampin  (RIF)  and  isoniazid  (INH)  are  commonly defined as multidrug resistant (MDR). Drug  resistance  in M. tuberculosis  is attributed primarily to  the  accumulation  of  mutations  in  the  drug  target  genes;  these  mutations  either  leading  to  an  altered  target or to an alternation in effective titration of the  drug (Rattan et al., 1998).   In  2008,  there  were  an  estimated  8.9–9.9  million  incident cases of TB, 9.6–13.3 million prevalent cases  of  TB  (WHO,  2009)  and  390,000–510,000  cases  of  MDRTB  (WHO,  2010).  Among  the  incident  TB  cases  globally,  3.6%  (95%  confidence  interval  (CI):  3.0–4.4)  are estimated to have MDR‐TB. Almost 50% of MDR‐TB  cases worldwide are estimated to occur  in China and  India. In 2008, MDR‐TB caused an estimated death of  150,000 people across the globe (WHO, 2010).   WHO  estimated  the  prevalence  of  all  types  of  tuberculosis  cases  for  Nepal  to  be  67,546  Nepal Journal of Biotechnology. Jan. 2011, Vol. 1, No. 1 : 14‐21  15   Biotechnology Society of Nepal (BSN), All rights reserved   (240/100,000). The proportion of MDR‐TB in Nepal was  2.9%  (95%  CI:  1.8‐4.3)  among  new  cases  and  11.7%  (95%  CI:  7.2‐17.7)  among  retreatment  cases  (NTC,  2009).  In  2009,  with  the  assistance  of  WHO,  National  TB  Center in collaboration with National Anti‐Tuberculosis  Association  (NATA)  and  German  Nepal  Tuberculosis  Project  (GENTUP)  had  conducted  a  surveillance  of  extremely drug‐resistant tuberculosis (XDR‐TB) among  the  registered  MDR  TB  patients.  The  study  showed  a  prevalence  of  5%  of  XDR‐TB  cases  among  MDR  TB  cases registered (NTC, 2009).  Isoniazid  (INH)  is  one  of  the  important  first‐line  tuberculosis  drugs.  MTB  is  highly  susceptible  to  INH,  with a Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of 0.03 ‐0.06 mg ml‐1. INH inhibits the biosynthesis of cell wall  mycolic  acids  (long  chain  α‐branched  ß‐hydroxylated  fatty  acids),  thereby  making  the  mycobacteria  susceptible  to  reactive  oxygen  radicals  and  other  environmental factors (Rattan et al., 1998). It is a pro‐ drug  that  requires  activation  by  the  MTB  catalase‐ peroxidase enzyme (KatG) to its active form. Mutation  of  the  KatG  gene,  which  leads  to  loss  of  or  reduced  catalase‐peroxidase  activity,  is  a  major  mechanism  of  INH  resistance  in  MTB  (Musser,  1995).  Although  various  mutations  in  the  KatG  gene  have  been  reported  in  INH‐resistant  isolates,  the  most  common  mutation  is the Ser315Thr mutation, which  is present  in approximately 50–90% of all INH‐resistant isolates, is  associated  with  relatively  high‐level  resistance to  INH  (Mokrousov et al., 2002).   More  than  one‐third  of  the  global  population  is  infected  with  MTB.  However,  only  10%  develop  the  clinical  disease.  Many  factors  contribute  to  the  immune  response  against  tuberculosis.  The  solute  carrier  family  11  member  1  gene  (SLC11A1,  formerly  known  as  NRAMP1:  natural  resistance  associated  macrophage protein 1)  is one of the candidate genes  for susceptibility to human tuberculosis (Takahashi et  al., 2008). The gene is located on human chromosome  2q35 and has 15 exons spanning about 14 kb (Marquet  et  al.,  2000).  The  gene  encodes  a  transmembrane  protein  expressed  exclusively  in  macrophages/ monocytes  and  polymorphonuclear  leukocytes.  The  protein acts as a transporter for divalent cations Fe2+,  Zn2+  and  Mn2+  and  has  pleiotropic  effects  on  macrophage activation (Goswami et al., 2001).  Studies  have  demonstrated  an  association  between  three  different  polymorphisms  (INT4,  D543N  and  3’UTR)  in  SLC11A1 and pulmonary TB (Taype et al., 2006).  In the present study, Ser315Thr KatG mutation  in the  MDR‐TB  culture  samples  and  G/C  polymorphisms  in  INT4  region  of  SLC11A1  of  TB  patients  were  studied  using  Polymerase  Chain  Reaction  (PCR)  ‐  Restriction  Fragment Length Polymorphism (RFLP) technique.  Materials and Methods  Study samples. 24 MTB Culture (all AFB stain positive)  samples were obtained from GENTUP, Kathmandu. The  cultured  samples  comprised  of  both  pulmonary  and  extra‐pulmonary origin. Drug Susceptibility Testing was  also carried out  in GENTUP and all of the 24 samples  were  graded  as  MDR‐TB.  24  whole  blood  samples  of  MDR‐TB  patients  were  also  obtained  for  SLC11A1  analysis. The samples were collected from the Central  Development  Region  of  Nepal.  However,  we  were  unable  to  obtain  the  clinical  history  of  the  test  subjects. Further molecular analysis was carried out in  a BSL‐III laboratory at Genetics Nepal Pvt. Ltd., Lalitpur,  Nepal.  Genomic  DNA  isolation  of  M.  tuberculosis.  DNA  isolation from cultured samples was done using SORPO  clean™  Genomic  DNA  extraction  kit.  A  loop  full  of  bacterial  colonies  from  the  culture  samples  were  suspended  in  200µl  of  sterile  water.  A  spin  column  extraction  was  carried  out  as  prescribed  by  the  manufacturer.  Human  genomic  DNA  isolation.  The  whole‐blood  samples  from  human  test  subjects  were  collected  in  EDTA  coated  vial  and  immediately  centrifuged  at  5000rpm/5min.  Plasma  was  separated  and  200µl  of  Figure 1: Prevalence of MDR‐TB in Nepal.   (Source: NTC, 2009)  Nepal Journal of Biotechnology. Jan. 2011, Vol. 1, No. 1 : 14‐21  16   Biotechnology Society of Nepal (BSN), All rights reserved   whole‐blood  was  taken  as  sample  for  further  processing. SORPO clean™ Genomic DNA extraction kit  was used for genomic DNA isolation. All the other steps  were same as described above.  Genomic  DNA  visualization:  The  extracted  DNA  was  visualized in a 0.8% agarose (Amresco®) gel.  PCR‐RFLP  analysis:  Amplification  of  the  200  bp  fragment with KatG codon 315 (the fragment  in KatG  from  nucleotide  positions  904  to  1103;  http:// genolist.pasteur.fr/TubercuList)  was  performed  in  TPersonal  Thermocycler  (Biometra®)  with  primers  katG1F and katG4RB (Mokrousov et al., 2002) (Table 1)  in  25µl  of  a  PCR  mixture  (0.4  μM  of  each  primers,  2.5mM  of  dNTP  mix,  1U  of  recombinant  Taq  DNA  polymerase (Fermentas®) and 2.5 mM of MgCl2) under  the  following  conditions:  initial  denaturation  at  94⁰C  for 5 min; 30 cycles of 94⁰C for 1 min, 56⁰C for 45 sec  and 72⁰C for 45 sec; and a final elongation at 72⁰C for 5  min.  The  amplified  fragment  was  assessed  by  electrophoresis  in a 2% agarose gel and cleaved with  restriction  enzyme  MspI  (HpaII)  (Fermentas®)  as  per  the  instructions  of  the  manufacturer.  The  restriction  fragments  obtained  were  electrophoresed  in  a  2%  agarose gel and were visualized under ultra‐violet (UV)  light on a transilluminator (Biometra®). M. tuberculosis  H37Rv was taken as the reference strain for this study.  PCR‐RFLP assay was designed to detect the KatG codon  mutation AGC(Ser) à ACC(Thr), which leads to the INH  resistant  phenotype.  This  mutation  creates  an  additional MspI site (CCGG) and thus can be detected  by use of this restriction endonuclease. As a result, the  longest  fragment  size  in  the  wild  type  KatG  product  would  be  153  bp  and  in  Ser315Thr  KatG  mutant  the  longest  fragment  would  be  132  bp  which  could  be  easily  resolved  in  a  2%  agarose  gel  while  the  shorter  bands  (21  bp  ‐  8  bp)  cannot  be  resolved  in  the  gel  (Figure 2).   Similarly, 514 bp of INT4 region of SLC11A1 gene was  amplified using primers INT4F and INT4R (Taype et al.,  2006) (Table 1).   A 25µl of a PCR mixture (0.4 μM of  each primers, 2.5mM of dNTP mix, 1U of recombinant  Taq  DNA  polymerase  and  2.5  mM  of  MgCl2)  was  prepared and the reaction was carried out under the  following  condition:  initial  denaturation  at  95⁰C  for  5  min; 30 cycles of 94⁰C for 1 min, 61°C for 1 min and  72⁰C for 1 min; and a final elongation at 72⁰C for 4 min.  The  amplified  fragment  was  assessed  by  electrophoresis in a 2% agarose gel. To analyze the G/C  polymorphisms  in  INT4,  the  amplified  products  were  cleaved  with  restriction  enzyme  ApaI  (Fermentas®)  as  per  the  instructions  of  the  manufacturer.  The  restriction  fragments  obtained  were  electrophoresed  in a 2% agarose gel and were visualized under UV light  on a transilluminator.   Results:  Genomic  DNA  visualization:  All  the  extracted  DNA  samples  displayed  a  positive  band  when  they  were  electrophoresed in 0.8% agarose gel. (Figure 3 and 4)  PCR‐RFLP analysis: All the 24 MTB DNA samples were  observed to have a positive amplification for KatG gene  fragment. An amplicon of 200 bp size were observed in  a 2% agarose gel (Figure 5).  In the electrophoresis of  the  KatG  amplified  product  digested  with  MspI,  4  (samples  015,  016,  020  and  024)  out  of  24  samples  were  obtained  at  132  bp  region  indicating  the  occurrence of Ser315Thr mutation whereas rest of the  20 samples were obtained at 153 bp region indication  no  Ser315Thr  mutation  (Figure  6).  Gel  picture  of  samples 015 and 016 are not shown.  All the 24 human DNA samples from whole blood had a  positive amplification at 514 bp region for INT4 (Figure  7).  When  these  amplicons  were  subjected  to  ApaI  digestion, all of the 24 samples were observed at 514  bp  region  indicating  no  G/C  polymorphisms  in  INT4  region of SLC11A1 (Figure 8).   Discussion  South Asia holds around 40% of the global TB burden  and  Nepal  has  no  different  scenario.  The  Millennium  Development  Goal  (MDG)  aims  to  eliminate  TB  as  a  public health problem (1 case per million population)  by 2050. Nepal has made satisfactory progress towards  MDG. However, the challenges to address the growing  burden of TB and MDR‐TB population are yet far away.  Nepal still lacks the health care facilities and access to  modern  diagnostic  technologies  is  very  poor  in  the  area (Basnet et al., 2009). Although Directly Observed  Treatment,  Short‐course  (DOTS)  strategy  has  significantly contributed towards the treatment of TB,  a  lack  of  rapid  and  sensitive  rapid  and  sensitive  methods  of  detection  is  a  major  hindrance  to  the  ongoing battle against the disease.  AFB  microscopy  is  the  primary  screening  tool  for  TB  and  culture  of  mycobacteria  is  still  regarded  as  the  “gold  standard”  in  TB  diagnosis.  But  these  days  new  Nepal Journal of Biotechnology. Jan. 2011, Vol. 1, No. 1 : 14‐21  17   Biotechnology Society of Nepal (BSN), All rights reserved   Target Gene Region  Primer  Sequence  KatG  katG1F  5'‐AGCTCGTATGGCACCGGAAC‐3’  katG4RB  5'‐AACGGGTCCGGGATGGTG‐3'  INT4  INT4F  5'‐GTCTGCCATCTCTACTACCCTAAGGTG‐3’  INT4R  5'‐CATGTCCCTCTAGGTATGTGCTATCAG‐3'  Table 1. Primer sequence for KatG and INT4  Figure  2.  Schematic  illustration  of  the  KatG  200‐bp  fragment  amplified  with  primers  katG1F  and  katG4RB.  The  vertical  line  represents  the  MspI  restriction  site  (CCGG).  In  the  wild‐type  KatG  PCR  product  there  is  no  MspI  restriction site at 315th Codon (AGC) and the  longest fragment  is of 153 bp. But  in the Mutant KatG PCR product  there is an addition of MspI restriction site at 315th codon (ACC) and it gives 132 bp band as the longest fragment.   Figure  3.  Visualization  of  the  extracted  MTB  DNA  from  cultured sample  in a 0.8% agarose gel. 020‐024 are the  DNA  samples,  PC  is  the  Positive  Control  and  NC  is  the  Negative Control. The bands are very close to the loading  well indicating the larger fragment of genomic DNA.   Figure 4. Visualization of the extracted DNA sample from  Human whole blood in a 0.8% agarose gel. 001‐005 are  the  DNA  samples,  PC  is  the  Positive  Control  and  NC  is  the  Negative  Control.  The  bands  are  very  close  to  the  loading  well  indicating  the  larger  fragment  of  genomic  DNA.   Nepal Journal of Biotechnology. Jan. 2011, Vol. 1, No. 1 : 14‐21  18   Biotechnology Society of Nepal (BSN), All rights reserved   Figure 5. PCR product of KatG gene fragment visualized  in a 2% agarose gel. 020‐024 are the MTB samples, PC is  the Positive Control and NTC is the No Template Con‐ trol. All the samples have positive band amplification at  200 bp region.   Figure 6.MspI digested product of KatG gene fragment  visualized  in  a  2%  agarose  gel.  020‐024  are  the  MTB  samples, PC is the Positive Control and NTC is the No  Template  Control.  Samples  021,  022,  and  023  has  a  band  size  of  153  bp  indicating  no  mutation  at  315th  codon  position  where  as  sample  020  and  024  has  a  band sized 132 bp indicating SeràThr mutation at 315th  codon position of KatG gene.   sensitivity and specificity.  The present study  looks at the resistance  in the KatG  Ser315Thr  towards  a  popular  anti‐TB  drug  isoniazid.  This  is  just  one  among  many  possible  mutations  in  KatG accounting for INH resistance. 4 (16.67%) samples  molecular  diagnostic  tools  are  promoted  globally  mostly in the detection of MTB, drug monitoring and in  MDR‐TB diagnosis (Pai et al., 2006). This is due to many  advantages  of  molecular  genomic  tools  over  conventional diagnostic methods that  lack the speed,  Figure 7. PCR product of INT4 gene fragment visualized  in  a  2%  agarose  gel.  001‐005  are  the  human  DNA  samples, PC  is the Positive Control and NTC  is the No  Template  Control.  All  the  samples  has  positive  band  amplification at 514 bp region   Figure 8. ApaI digested product of INT4 gene fragment  visualized in a 2% agarose gel. 001‐002 are the Human  DNA samples, PC is the Positive Control and NTC is the  No Template Control. All the samples were observed at  514 bp region indicating no G/C polymorphisms in INT4  region of SLC11A1 gene   Nepal Journal of Biotechnology. Jan. 2011, Vol. 1, No. 1 : 14‐21  19   Biotechnology Society of Nepal (BSN), All rights reserved   out  of  24  MTB  culture  samples  demonstrated  Ser315Thr KatG mutation (i.e. these samples were INH  resistant).  It  indicates  that  there  could  possibly  be  significantly  high  anti‐TB  drug  resistant  population  if  screened in a larger population. One of the drawbacks  of  this  study  is  that  other  mutation  in  various  genes  (InhA,  OxyR,  AhpC)  that  contributes  to  the  INH  resistance  were  not  studied.  Studies  have  reported  that even if there is Ser315Ther KatG mutation, it does  not necessarily account to INH resistance and have an  overall high level of catalase activity (Guo et al., 2006).  Both  the  catalase  activity  and  drug  sensitivity  information could not be obtained.   The association between SLC11A1 polymorphisms and  susceptibility  to  tuberculosis  has  been  described  in  many  studies,  which  showed  positive  association  in  some, while no association in others (Takahashi et al.,  2008).  A  study  showed  that  NRAMP1  polymorphisms  may be associated with progression to severe forms of  pulmonary tuberculosis rather than with susceptibility  to M. tuberculosis infection (Zhang et al., 2005). All the  INT4  amplicons  when  subjected  to  ApaI  digestion,  bands of 514 bp were observed. If the INT4 region had  G/C polymorphisms then restriction site(s) would have  been additionally created and the RFLP bands of <500  bp size would have been observed.  This indicates that  no  G/C  polymorphism  was  present  in  the  amplified  Figure 9. Percentage Distribution of KatG Ser315Thr Mu‐ tation   Sample ID  AFB Stain  MTB Culture  MDR‐TB  KatG PCR ampli‐ con size (bp)  MspI digested  product size  (bp)  Ser315Thr KatG  mutation  MTB‐001  POSITIVE  POSITIVE  POSITIVE  200  153  NEGATIVE  MTB‐002  POSITIVE  POSITIVE  POSITIVE  200  153  NEGATIVE  MTB‐003  POSITIVE  POSITIVE  POSITIVE  200  153  NEGATIVE  MTB‐004  POSITIVE  POSITIVE  POSITIVE  200  153  NEGATIVE  MTB‐005  POSITIVE  POSITIVE  POSITIVE  200  153  NEGATIVE  MTB‐006  POSITIVE  POSITIVE  POSITIVE  200  153  NEGATIVE  MTB‐007  POSITIVE  POSITIVE  POSITIVE  200  153  NEGATIVE  MTB‐008  POSITIVE  POSITIVE  POSITIVE  200  153  NEGATIVE  MTB‐009  POSITIVE  POSITIVE  POSITIVE  200  153  NEGATIVE  MTB‐010  POSITIVE  POSITIVE  POSITIVE  200  153  NEGATIVE  MTB‐011  POSITIVE  POSITIVE  POSITIVE  200  153  NEGATIVE  MTB‐012  POSITIVE  POSITIVE  POSITIVE  200  153  NEGATIVE  MTB‐013  POSITIVE  POSITIVE  POSITIVE  200  153  NEGATIVE  MTB‐014  POSITIVE  POSITIVE  POSITIVE  200  153  NEGATIVE  MTB‐015  POSITIVE  POSITIVE  POSITIVE  200  132  POSITIVE  MTB‐016  POSITIVE  POSITIVE  POSITIVE  200  132  POSITIVE  MTB‐017  POSITIVE  POSITIVE  POSITIVE  200  153  NEGATIVE  MTB‐018  POSITIVE  POSITIVE  POSITIVE  200  153  NEGATIVE  MTB‐019  POSITIVE  POSITIVE  POSITIVE  200  153  NEGATIVE  MTB‐020  POSITIVE  POSITIVE  POSITIVE  200  132  POSITIVE  MTB‐021  POSITIVE  POSITIVE  POSITIVE  200  153  NEGATIVE  MTB‐022  POSITIVE  POSITIVE  POSITIVE  200  153  NEGATIVE  MTB‐023  POSITIVE  POSITIVE  POSITIVE  200  153  NEGATIVE  MTB‐024  POSITIVE  POSITIVE  POSITIVE  200  132  POSITIVE  Table 2. Relationship between AFB Stain, MTB Culture and PCR‐RFLP Results  Nepal Journal of Biotechnology. Jan. 2011, Vol. 1, No. 1 : 14‐21  20   Biotechnology Society of Nepal (BSN), All rights reserved   region of INT4. The present study shows no significant  association between G/C polymorphism INT4 region of  SLC11A1 with TB. With the limited number of samples  and failure to study D543N and 3’UTR region, the role  of  SLC11A1  in  susceptibility  towards  TB  cannot  over‐ ruled.  As  WHO  claims  one‐third  of  the  world’s  population  to  be  infected  with  latent  form  of  TB,  SLC11A1  polymorphisms  can  be  accredited  to  be  a  helping factor for TB susceptibility or progression.  This study has considered M. tuberculosis H37Rv as a  reference  strain  but  other  clinical  strain  could  also  have been prevalent. This fact remained as a challenge  SampleID  MDR‐TB  INT4 PCR amplicon size  (bp)  ApaI digested product of  INT4 (bp)  G/C Polymorphism in INT4  SLC‐001  POSITIVE  514  514  NEGATIVE  SLC‐002  POSITIVE  514  514  NEGATIVE  SLC‐003  POSITIVE  514  514  NEGATIVE  SLC‐004  POSITIVE  514  514  NEGATIVE  SLC‐005  POSITIVE  514  514  NEGATIVE  SLC‐006  POSITIVE  514  514  NEGATIVE  SLC‐007  POSITIVE  514  514  NEGATIVE  SLC‐008  POSITIVE  514  514  NEGATIVE  SLC‐009  POSITIVE  514  514  NEGATIVE  SLC‐010  POSITIVE  514  514  NEGATIVE  SLC‐011  POSITIVE  514  514  NEGATIVE  SLC‐012  POSITIVE  514  514  NEGATIVE  SLC‐013  POSITIVE  514  514  NEGATIVE  SLC‐014  POSITIVE  514  514  NEGATIVE  SLC‐015  POSITIVE  514  514  NEGATIVE  SLC‐016  POSITIVE  514  514  NEGATIVE  SLC‐017  POSITIVE  514  514  NEGATIVE  SLC‐018  POSITIVE  514  514  NEGATIVE  SLC‐019  POSITIVE  514  514  NEGATIVE  SLC‐020  POSITIVE  514  514  NEGATIVE  SLC‐021  POSITIVE  514  514  NEGATIVE  SLC‐022  POSITIVE  514  514  NEGATIVE  SLC‐023  POSITIVE  514  514  NEGATIVE  SLC‐024  POSITIVE  514  514  NEGATIVE  Table 3. Relationship MDR‐TB and G/C polymorphism in INT4 region of SLC11A1  to  our  study  as  no  base‐line  study  on  MTB  strain  genotyping  has  been  conducted  for  Nepalese  MTB  isolates till date.  Conclusion  The  findings  in  this  study  suggests  that  still  more  people could be properly diagnosed for the actual drug  resistance  mutations  utilizing  molecular  genomic  diagnostic tools. Further study with a greater number  of  MDR‐TB  patients  is  needed  to  get  the  actual  scenario of TB population of Nepal.   Reference  World Health Organization. Global Tuberculosis  Control. A short update to the 2009 report. 2009    World Health Organization. Multidrug and extensively  drug‐resistant TB (M/XDR‐TB) 2010 Global Report on  Surveillance and Response. 2010    National  Tuberculosis  Center.  National  Tuberculosis  Control  Programme  Nepal  ‐  Annual  Report  FY  2065/66 (2008/2009). 2009  Musser  JM.  Antimicrobial  agent  resistance  in  mycobacteria:  molecular  genetic  insights.  Clin  Microbiol Rev. 1995 Oct;8(4):496‐514.  Nepal Journal of Biotechnology. Jan. 2011, Vol. 1, No. 1 : 14‐21  21   Biotechnology Society of Nepal (BSN), All rights reserved   Rattan  A,  Kalia  A,  Ahmad  N.  Multidrug‐resistant  Mycobacterium  tuberculosis:  molecular  perspectives.  Emerg  Infect  Dis.  1998  Apr‐Jun;4 (2):195‐209.  Mokrousov  I,  Narvskaya  O,  Otten  T,  Limeschenko  E,  Steklova  L,  Vyshnevskiy  B.  High  prevalence  of  KatG  Ser315Thr  substitution  among  isoniazid‐resistant  Mycobacterium  tuberculosis  clinical  isolates  from  northwestern  Russia,  1996  to  2001.  Antimicrob  Agents Chemother. 2002 May;46(5):1417‐24.  Takahashi  K,  Hasegawa  Y,  Abe  T,  Yamamoto  T,  Nakashima  K,  Imaizumi  K,  Shimokata  K.  SLC11A1  (formerly  NRAMP1)  polymorphisms  associated  with  multidrug‐resistant  tuberculosis.  Tuberculosis  (Edinb). 2008 Jan;88(1):52‐7.  Marquet S, Lepage P, Hudson TJ, Musser JM, Schurr E.  Complete  nucleotide  sequence  and  genomic  structure  of  the  human  NRAMP1  gene  region  on  chromosome  region  2q35.  Mamm  Genome  2000,  11:755‐762.  Goswami T, Bhattacharjee A, Babal P, Searle S, Moore  E,  Li  M,  Blackwell  JM.  Natural‐resistanceassociated  macrophage  protein  1  is  an  H+/bivalent  cation  antiporter. Biochem J 2001; 354: 511–519.  Taype CA, Castro JC, Accinelli RA, Herrera‐Velit P, Shaw  MA,  Espinoza  JR.  Association  between  SLC11A1  polymorphisms and susceptibility to different clinical  forms  of  tuberculosis  in  the  Peruvian  population.  Infect Genet Evol. 2006 Sep;6(5):361‐7.  Pai  M,  Kalantri  S,  Dheda  K.  New  tools  and  emerging  technologies for the diagnosis of tuberculosis: part II.  Active  tuberculosis  and  drug  resistance.  Expert  Rev  Mol Diagn. 2006 May;6(3):423‐32.  Basnet R, Hinderaker SG, Enarson D, Malla P, Mørkve  O.  Delay  in  the  diagnosis  of  tuberculosis  in  Nepal.  BMC Public Health. 2009 Jul 14;9:236.  Guo H, Seet Q, Denkin S, Parsons L, Zhang Y. Molecular  characterization of isoniazid‐resistant clinical isolates  of Mycobacterium tuberculosis from the USA. J Med  Microbiol. 2006 Nov;55(Pt 11):1527‐31.  Zhang W, Shao L, Weng X, Hu Z, Jin A, Chen S, Pang M,  Chen  ZW.  Variants  of  the  natural  resistance‐ associated  macrophage  protein  1  gene  (NRAMP1)  are  associated  with  severe  forms  of  pulmonary  tuberculosis. Clin Infect Dis. 2005 May 1;40(9):1232‐ 6. Epub 2005 Mar 23.