2 Nepal Journal of Biotechnology. Jan. 2011, Vol. 1, No. 1 : 9‐13  9   Biotechnology Society of Nepal (BSN), All rights reserved   ORIGINAL RESEARCH ARTICLE  An Evaluation of the Fungi Isolated from Sub‐ epidermal Region of Post‐harvested Stored Wheat  Grains  Shiju Mathew1, George Thomas2, Tufail Ahmad3  1 Ministry of Higher Education, Aksum University, Aksum (Ethiopia)  2 Department of Molecular Biology & Genetic Engineering, Allahabad  Agricultural Institute ‐Deemed University, Allahabad 211007 (India)  3  Department of Agriculture Process and Food Engineering, Allahabad  Agricultural Institute – Deemed University, Allahabad 211007 (India)  Abstract  The  criteria  of  wheat  quality  are  as  varied  as  their  different  uses.  Wheat,  which  is  suitable  for  a  particular use / product, may have certain characters that make it entirely unsatisfactory for other  purposes.  The  storage  fungi  damage  the  grains  in  several  ways;  they  reduce  the  germinability,  produce undesirable odor and kernel discoloration, decrease the food value and also produce toxins  injurious  to  the  health  of  consumers.  The  sub‐epidermal  mycoflora  of  stored  wheat  grains  predominantly consisted of ubiquitous mould genera Aspergillus, Alternaria and Penicillium possibly  because  of  their  omnipresence,  capacity  to  grow  on  all  possible  substrates  and  a  wide  range  of  temperature  and  humidity.  The  most  frequent  species  observed  in  the  stored  wheat  grains  of  Aspergillus  were  A.  niger  and  A.  fumigates,  Alternaria  alternata  and  Pencillium  citrinum.  Among  these the frequency of Alternaria alternata was highest which has the capacity to produce mycotoxin  which can contaminate and cause spoilage. The grain losses found in quantity and quality; can be in  the  form  of  depletion  in  seed  viability,  hardness,  color,  size  and  shape,  grain  weight  and  various  biochemical parameters viz., protein, carbohydrate and vitamins under post harvest storages.     Key words: wheat, post‐harvest, storage, sub‐epidermal fungi and spoilage.    Correspondence Author:  E‐mail: shijumathew_biotech@yahoo.com; Contact no.: (+251) 920126043  Introduction  Grain  production  in  any  country  varies  from  year  to  year  and  hence  the  grains  should  be  stored  strategically  from  years  of  overproduction  for  use  in  year of under production. Grain quality after harvest is  influenced  by  a  wide  variety  of  biotic  and  abiotic  factors  and  has  been  studied  as  a  stored  grain  ecosystem.  Spoilage  of  stored  grain  by  fungi  is  determined  by  a  range  of  factors  which  can  be  classified  into  four  main  groups  including  (a)  intrinsic  nutritional  factors,  (b)  extrinsic  factors  (c)  processing  factors  and  (d)  implicit  microbial  factors.  The  factors  produce  fungal  colonization  within  the  stored  grains  (Wallace and Sinha, 1981; Sinha, 1995). In 1970s, it was  considered for the first time that the stored grain as a  manmade ecosystem which needed to be examined in  a  more  holistic  and  ecological  manner  to  enable  a  proper  understanding  of  the  processes  occurring  and  to  improve  post‐harvest  management  of  stored  food  commodities of all types. The post harvest losses at the  farm  level  have  been  estimated  to  be  3.28  kg/q  in  wheat. The post harvest loss of wheat grain has been  found  to  be  highest  during  storage  (Magan  et  al.,  2003). Stored grains can have  losses  in both quantity  and quality. Losses occur when the grain is attacked by  microorganisms and other organisms including insects,  mites, rodents and birds (Neetirajan et al., 2007).  The  wheat  grains  come  in  association  with  the  fungi  from the time of grain maturity and also at the time of  storage.  Some  of  these  fungi  are  in  intimate  association  and  are  present  as  dormant  mycelium  under the pericarp or dormant spores on the surface of  Nepal Journal of Biotechnology. Jan. 2011, Vol. 1, No. 1 : 9‐13  10   Biotechnology Society of Nepal (BSN), All rights reserved   the  kernel.  However,  there  are  a  number  of  fungi  which  are  only  superficially  associated  with  stored  grains.  The  mycelium  was  usually  septate,  thin  and  branching  repeatedly  to  form  a  network  on  the  sub‐ epidermal surface of stored wheat grains. Sometimes,  due  to  more  frequent  formation  of  transverse  walls,  beaded cells were seen. The sub‐epidermal mycelium  was observed even in apparently, healthy, undamaged  grains  examined  superficially  with  hand  lens.  The  association of fungi with cereal grains starts from the  field itself. Shortly after the grain reaches to maximum  size,  the  lemma  and  palea  protecting  it  are  pushed  apart  exposing  the  grain  to  infection  by  fungi  (Machacek  and  Greaney,  1938)  and  their  extensive  studies has been carried out in the laboratory on these  aspects  (Sankaran  et  al.,  1975;  Sankaran,  1976;  Sankaran  et  al.,  1976).  An  extensive  microflora  has  been found to be associated with stored wheat grains  (Duggeli, 1904; Kent‐ Jones and Amos, 1930; James et  al.,  1946;  Christensen,  1956;  Poisson  and  Guilbot,  1956;  Inagaski and  Ikeda, 1959; Field and King, 1962;  Brook  and  White,  1966;  Graves  et  al.,  1967;  Pelhate,  1968;  Hesseltine,  1968;  Wallace,  1973).  Earlier  in  the  laboratory  a  number  of  cereals  have  been  screened  with respect to microflora associated in storage grains  (Basu,  1974;  Mehrothra,  1974;  Palni,  1975;  Jayas,  1995). Fungal activity can cause undesirable effects in  grains  including  discolouration,  contribute  to  heating  and  losses  in  nutritional  value,  produce  off‐odours,  losses  in  germinability,  deterioration  in  baking  and  milling  quality,  and  can  result  in  contamination  by  mycotoxins (Hocking, 2003; Magan et al., 2003).  Materials and Methods  The  investigation  was  done  at  Allahabad  Agricultural  Institute‐Demmed University, Allahabad in India. . The  work  was  an  attempt  to  correlate  the  sub‐epidermal  fungal  infestation  and  quality  of  wheat  grain  under  storage. The wheat samples were collected separately  in  3  replicates  for  each  of  the  wheat  (Triticium  aestivum L.) varieties viz., U.P. 262 and H.D. 1982 from  F.C.I.  godown,  Naini,  Allahabad  district,  whole  sale  dealers from Naini and Muttiganj markets of Allahabad  and from the local farmers. The samples were brought  to the  laboratory under aseptic condition where they  were screened (before washing and after washing with  water) for their associated sub‐epidermal fungal flora.  Out of these, some samples were heavily infested with  fungi, some were slightly infested and some were not  at  all  infested.  Twenty  samples  of  wheat  grains  belonging to two different varieties were screened for  the presence of sub‐epidermal mycelium. Five different  sample  collection  sites  were  selected  and  12  month  stored  (moisture  content  8‐16%)  samples  were  screened  within  a  week  of  their  collection.  One  hundered  grains  from  each  samples  were  taken  randomly, they were examined for the presence of sub ‐epidermal mycelium within the grain by the method of  Hyde and Galleymore (1951) as described below:   1.  The  grain  without  cracks  and  holes  on  their  epidermis were soaked in water for a short period  and  then  the  epidermis  was  peeled  off  with  forceps.  2.  The stored grains were also examined superficially  with a hand lens (10 X).  3.  The  peeled  epidermis  contains  sub‐epidermal  mycelium.  4.  The  epidermis  was  then  placed  in  aniline  blue  (0.2%  in  66%  lactic  acid)  and  warmed  for  5  –  10  minutes which stained the mycelium alone and the  epidermal cells were left unstained.  The  sub‐epidermal  fungi  was  brought  into  culture  by  first  surface  disinfecting  the  soaked  grains  by  immersion  for  two  minutes  in  0.2%  sodium  hypochlorite  and  washing  in  two  changes  of  sterile  water. Then the peeling of the epidermis were taken  out  and  transferred  to  five  different  culture  medium  viz.,  Czapek’s  solution  agar,  Czapek’s  osmophilic  solution  agar,  Malt  extract  agar,  Wheat  extract  agar  and oat meal agar with the following composition:  1.  Czapek’s  solution  agar  media,  Oat  meal  Agar  Media and Malt extract agar: The composition of  these media has been mentioned above.  2.  Czapek’s  osmophilic  solution  agar:  Same  as  Czapek’s  solution  agar  media  except  for  sucrose  which is 20% instead of 3%.  3.  Wheat extract agar:  Wheat extract 20g; Agar, 30g;  Yeast extract, 0.5g; Distilled water, 1000ml.    The culture was incubated at 25± 2 0C for 7 days.  Each set of experiment had a control to differentiate  the  laboratory  contaminants  from  the  microflora  actually  associated  with  the  sample.  The  fungal  colonies were isolated and  identified with the help of  authentic  literature.  The  frequency  of  occurrence  of  different  fungi  isolated  from  wheat  samples  was  calculated by the following formula;                                                           Nepal Journal of Biotechnology. Jan. 2011, Vol. 1, No. 1 : 9‐13  11   Biotechnology Society of Nepal (BSN), All rights reserved   The  various  media  used  for  the  identification  of  subepidermal  fungi  with  different  composition  of  Czepek’s  solution  agar  {NaNO3  (3.0  g);  K2PO4  (1.0  g);  KCL (0.5 g); MgSO4 .7H2O (0.5 g); FeSO4 .7H2O (0.01 g);  Sucrose (30.0 g); Agar (20.0 g); Distilled water (1000.0  ml);  PH  6.5)},  Czepek’s  yeast  agar  {  K2HPO4  (1.0  gm);  Czepek’s concentrate (10.0 gm); Yeast extract (5.0 gm);  Sucrose  (30.0  gm);  Agar  (20.0  gm);  Distilled  water  (1000.0 ml); PH 6.5}, malt extract agar {Malt – Extract  (20.0 g); Peptone (1.0 g); Dextrose (20.0 g); Agar (20.0  g);  Distilled  water  (1000.0 ml)  PH  6.5}, Oat  meal  agar  {Oat meal (20.0 g); Yeast extract  (0.5 g); Agar (20.0 g);  Distilled  water  (1000.0  ml);  PH  6.5},  Potato‐dextrose  agar {Potato Dextrose (20.0 g); Agar (20.0 g); Distilled  water  (1000.0  ml);  PH  6.5},  Peptone  agar  {Peptone  (10.0  g);  Dextrose  (20.0  g);  Agar  (20.0  g);  Distilled  water  (1000.0  ml);  PH  6.5}  and  Synthetic  mucor  agar { Dextrose (20.0 g); Asparagine (2.0 g); KH2PO4 (0.5 g);  MgSO4  .7H2O  (0.25  g);  Thiamine  chloride  (0.5  g);  Distilled water (1000.0 ml); PH 6.5}. These media were  sterilized at 1210C and 15 lbs p.s.i. for 20 minutes.  Results and Discussion  The result of sub‐epidermal fungi in the stored wheat  grain  varieties  U.P.  232  and  H.D.1982  collected  from  different sites of Allahabad are given in Figure 1. Sub‐ epidermal mycelium was seen in all samples screened.  These mycelia were usually septate, thin and branching  repeatedly to form a network. Sometimes, due to more  frequent  formation  of  transverse  walls,  beaded  cells  were seen. Four species of fungi as shown  in Table 1  were  isolated  from  sub‐epidermal  region  of  wheat  grains and the microscopic view  is shown  in Figure 2.  The  most  common  storage  fungi  observed  in  the  stored  wheat  grain  samples  was  Alternaria  alternata  (14.6%). Species of Aspergillus were also encountered  with A. fumigatus (10.5%), and A. niger (8.3%) followed  by  Penicillium  citrinum  (3.8%).  The  sub‐epidermal  mycelium  was  observed  even  in  apparently,  healthy,  undamaged  grains  examined  superficially  with  hand  lens  prior  to  peeling.  Sporophores  were  sometimes  seen emerging from the groove region or from cracks  and holes on the smooth surface of the stored wheat  grain.   The  entry  of  the  fungus  in  stored  grains  could  be  through the epidermis as the sub‐epidermal mycelium  was  observed  even  in  apparently  healthy  grains  examined  superficially  with  a  hand  lens  and  prior  to  peeling. However, sporophores were sometimes seen  emerging in the groove region or from the cracks and  holes  in  the  smooth  surface.  Simmonds  (1968)  observed that infection takes place through the cracks  in the epidermis or the opening over the embryo since  abundant fungal fruiting was evident where cracks had  occurred. Welling (1968) found that Aspergillus species  infected  seeds  independent  of  the  amount  of  injury.  The  mature  stored  wheat  grains  were  found  to  have  more  injury.  Hyde  and  Galleymore  (1951)  observed  that  mature  grains  contain  more  internal  mycelia.  Flannigan  (1974)  also  found  Alternaria  alternata  in  78.5%  of  the  wheat  grains  established  fungi  with  Alternaria  alternata  was  among  the  ones  which  appeared later.  Reports from various countries show that this species  is  found  to  be  the  most  common  post  harvest  fungi.  Saponaro and Madaluni (1960) reported the presence  of Aspergillus  in stored wheat grains  in  Italy, Wallace  and  Sinha  (1962)  in  Canada,  Kurata  et  al.  (1968),  Tsunado (1970) and Tsuruta (1970) in Japan. However,  James and Smith, 1948 from Canada reported A. niger  stood second with respect to frequency of occurrence  of fungi in stored wheat grains.  Conversely Aspergillus  and Penicillium are more often considered as ‘storage  fungi’.  They  are  known  to  form  mycotoxins  in  stored  grains and are usually not regarded as fungi that can  produce  mycotoxins  before  harvest  (Frisvad,  1995;  Wicklow, 1995; Hockings, 2003)  Acknowledgements  I  gratefully  acknowledge  the  cooperation,  uninterrupted  guidance,  impeccable  and  valuable  suggestions  rendered  to  me  by  Prof.  (Dr.)  George  Thomas during my research work.   S. No.  Organisms  Frequency of occurrence (%)  1  Alternaria alternata  14.6  2  Aspergillus fumigatus  10.5  3  Aspergillus niger  8.3  4  Penicillium citrinum  3.8  Table 1: Frequency of fungi isolated from sub ‐epidermal region of stored wheat  Nepal Journal of Biotechnology. Jan. 2011, Vol. 1, No. 1 : 9‐13  12   Biotechnology Society of Nepal (BSN), All rights reserved   Figure 1:  The colonies developed on the Czapek’s solu‐ tion agar of the stored grain fungi  Figure 2: Schematic showing isolated fungal colonies under micro‐ scopic view i) Aspergillus fumigatus ii) Aspergillus niger iii) Alternaria  alternate iv) Penicillium citrinum  References   Basu:  Studies  of  microorganisms  associated  with  stored wheat and  its flour  in  India. Research paper  presentation at University of Lucknow, India; 1974.  Brook PJ, White, EP: Fungus toxins affecting mammals.  Ann. Rev. Phytopathol. 1966, 4: 171‐194.  Christensen,CM:  Deterioration  of  stored  grains  by  moulds. Wallerstein Lab. Commun. 1956, 19 : 31‐48.  Duggeli  M:  The  mycological  florainfection.  Zentr.  Microbial Infection 1904, 12: 602‐614.  Field  RW and King  TH:  Influence  of  storage  fungi    on  the deterioration of corn  in storage a review. Lowa  Acad. Sci. 1962, 51: 265‐280.  Flannigan B: Distribution of seed borne microorganism  in naked barley and wheat before harvest. Trans. Br.   Mycol. Soc. 1974, 62: 51‐58.  Frisvad  JC:  Mycotoxins  and  mycotoxigenic  fungi  in  storage.  In:  Stored  grain  ecosystems.  (D.S.  Jayas,  N.D.G.  White,  and  W.E  .Muir,  eds.).  New  York,  Marcel Dekker.1995, 251‐288.  Graves  RR  Rogers  RF  Lyons  AJ  Jr.,  Hesseltine  CW:  Bacterial  and  actinomycetes  flora  of  Kansas  –  Nebraska  and  Pacific  Northwest  wheat  and  wheat  flour. Cereal Chem. 1967 44: 288‐299.  Hesseltine  CW:  Flour  and  wheat:  Research  on  their  microbiological  flora,  Bakers  Dig.  1968,  42:  40‐42,  66.  Hocking  AD:  Stored  grain  in  Australia  2003.   Proceedings of the Australian Postharvest Technical  Conference, Canberra. CSIRO Stored Grain Research  Laboratory, Canberra. 2003; pp. 55‐58.  Hyde  M,  Olly  B,  Galleymore  HB:  The  subepidermal  fungi  of  cereal  grains  II.  The  nature  identify  and  origin  of  the  mycelium  in  wheat.  Ann.  Application  Biol. 1951, 8: 248‐356.  Inagaski N, Ikeda M: Studies on the fungi isolated from  foods  II.  Identification  of  Penicillia  and  Aspergilli  from flour. Bull. Nat. Hygenic Lab. Tokyo. 1959,  77:  347‐366.  James  N,  Wilson,  J,  Stark  E:  The  microflora  of  stored  wheat. Can. J. Res. 1946, 24: 224‐233.  Jayas DS: Stored‐grain ecosystems. New York: Dekker.  1995, pp. 757.  Kent‐Jones  DW,  Amos  AJ:  Preliminary  studies  in  bacteriology  of  wheat  and  flour.  Analyst.  1930,  55:  248‐268.  Machacek  JE,  Greaney  FJ:  The  block  point  of  kernel  smudge disease of cereals. Can. J. Res. 1938, 16: 84‐ 113.  Magan  N,  Hope  R,  Cairns  V,  Aldred  D:  Post‐harvest  fungal  ecology:  impact  of  fungal  growth  and  mycotoxin accumulation in stored grain. European J.  Plant Pathol. 2003, 109: 723‐730.  Mehrothra  DK:  Studies  on  some  microrganisms  associated  with  rice  in  storage.  Paper  presentation  Abstract at University of Lucknow. 1974.  Neethirajan  S,  Karunakaran  S,  Jayas  DS,White  NDG:  Nepal Journal of Biotechnology. Jan. 2011, Vol. 1, No. 1 : 9‐13  13   Biotechnology Society of Nepal (BSN), All rights reserved   Detection  techniques  for  stored‐product  insects  in  grain. Int. Fd. Control. 2007, 18: 157‐162.  Palni  IK:  Studies  on  the  microflora  associated  with  wheat  grains  and  various  milling  fraction.  Paper  presentation. Abstract, University of Lucknow. 1975.  Pelhate  J:  Inventaire  de  la  mycoflora  des  bles  de  conservation    (Inventory  of  mycoflora  of  stored  wheat) Bull. Soc. Mycol. France  1968, 84: 127‐143.  Poisson  J,  Guilbot  MA:  Mycoflora  des  Farines  Franscaises. Menuerie, France 1956, pp 42‐52.  Sankaran  R:  Mould  Problems  in  the  Storage  of  Food  Grains. Symposium ‘Stratergies on Storage, Handling  and  Processing  of  Food  Grains  in  the  Present  Context'.  Bangalore  Chapter  of  Association  of  Food  Scientists and Technologists, India 1976.  Sankaran  R,    Sehgal  DD,  Parihar  DB,  Nath  H:  Cereal  grain  fungi  and  grain  quality.    Def.  Sci.  1976,    26:   161.  Sankaran R, Mattada RR, Thangamani: Mycoflora and  changes of wheat seed quality during storage.  Itzd.  Fd. Packer. 1975, 29: 1.  Tsunoda H: Microorganisms which deteriorates stored  cereals  and  grains.  In:  Toxic  microorganisms  (M.  Herzberg,  ed.).  Published  by  UJNR  Joint  Panels  on  toxic  microorganisms  and  the  U.S.  Department  of  Interior Washington D.C. 1970.  Tsuruta  O:.  Microorganisms  in  stored  grains.  Training  manual on storage and preservation of wheat grain  1970, pp. 307.  Tuite  JF,  Christensen  CM:  Grain  storage  studies  24:  Moisture  content  of  wheat  seed  in  relation  to  invasion of seed by species of the Aspergillus glaucus  group and the effect of invasion upon germination of  the seed. J. Phytopathol.  1957, 47: 323‐327.  U.S.  Department  of  Agriculture:  Annual  World  Production Summary, Grains, http://www.usda.gov/ Agriculture crop production. 2003.  Wallace  HAH:  Fungi  and  other  organisms  associated  with stored grains  in grain storage part of a system  (R.N. Sinha and W.E. Muir, eds.). AVI publishing Co.,  Connecticut Sec. II Capt. 1973, 4 : 71‐78.  Wallace  HAH  Sinha  RN:  Causal  factors  operative  in  distributional  patterns  and  abundance  of  fungi:  a  multivariate  study.  In:  The  Fungal  Community‐  Its  Organisation  and  Role  in  Ecosystems  (D.T.  Wicklow  and      G.C.  Carroll,  eds.).    Marcell  Dekker  Inc.,  New  York. 1981, pp. 233‐247.  Wicklow  DT:  The  mycology  of  stored  grain:  an  ecological  perspective.  In:  Stored  grain  ecosystems  (D.  S.  Jayas,  N.  D.  G.  White  and  W.  E.  Muir,  eds.).  New York, Marcel Dekker. 1995, pp. 197‐249.