56 RBCIAMB | n.42 | dez 2016 | 56-66 Thais Reis Victorino Engenheira Química pela Universidade Federal Fluminense (UFF). Mestre em Engenharia de Biossistemas pela UFF – Niterói (RJ), Brasil. Roberto Guimarães Pereira Engenheiro Mecânico pela Universidade Gama Filho (UGF). Doutor em Engenharia Mecânica pela Pontifícia Universidade Católica do Rio de Janeiro (PUC-Rio). Professor Titular do Departamento de Engenharia Mecânica da UFF – Niterói (RJ), Brasil. Sorele Batista Fiaux Engenheira Química pela Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ). Doutora em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos pela UFRJ. Professora Associada do Departamento de Tecnologia Farmacêutica da UFF – Niterói (RJ), Brasil. Endereço para correspondência: Sorele Batista Fiaux – Universidade Federal Fluminense – Faculdade de Farmácia, Universidade Federal Fluminense – Rua Mário Viana 523 – Santa Rosa – 24241-000 – Niterói (RJ), Brasil – E-mail: sorele_fiaux@id.uff.br RESUMO Glicerina tem sido gerada em grandes quantidades como um subproduto da indústria do biodiesel. Este estudo teve por objetivo avaliar o crescimento do fungo Aspergillus niger em um meio contendo glicerina de biodiesel e compará-lo com aquele obtido em meios com glicerol e sacarose, uma matéria-prima já usada em processos microbianos industriais. A glicerina foi obtida por transesterificação de óleo de cozinha residual com etanol e usada sem nenhuma purificação. O crescimento microbiano na glicerina foi comparável àquele obtido na sacarose e maior do que o obtido em glicerol. A glicerina impura provou-se uma matéria-prima apropriada para processos biotecnológicos utilizando Aspergillus niger. A utilização tecnológica desses dois passivos ambientais, a glicerina e o óleo de cozinha residual, contribui para a diminuição dos impactos ambientais e econômicos decorrentes de sua geração e descarte. Palavras-chave: glicerina; óleo de cozinha residual; Aspergillus niger; biodiesel. ABSTRACT Glycerin has been generated in large quantities as a byproduct of biodiesel production. This study aimed to evaluate the development of the fungi Aspergillus niger on medium containing glycerin from biodiesel and to compare it with that obtained in media with glycerol and sucrose, a raw material used in microbial industrial process. The glycerin was obtained by transesterification of waste cooking oil with ethanol and used without any previous purification. The microbial growth in glycerin was comparable to that obtained with sucrose and bigger than that obtained with glycerol. This impure glycerin proved to be a suitable raw material for Aspergillus niger biotechnological process. Technological use of these two environmental liabilities, glycerin and residual cooking oil, contributes to reduce the environmental and economic impacts of their generation and disposal. Keywords: glycerin; waste cooking oil; Aspergillus niger; biodiesel. DOI: 10.5327/Z2176-947820160107 APROVEITAMENTO DA GLICERINA DE BIODIESEL OBTIDA A PARTIR DE ÓLEO DE FRITURA PARA O CULTIVO DO FUNGO ASPERGILLUS NIGER USE OF CRUDE GLYCERIN FROM WASTE COOKING OIL BIODIESEL FOR THE CULTIVATION OF THE FUNGUS ASPERGILLUS NIGER Aproveitamento da glicerina de biodiesel obtida a partir de óleo de fritura para o cultivo do fungo aspergillus niger 57 RBCIAMB | n.42 | dez 2016 | 56-66 INTRODUÇÃO Devido à elevada demanda pela industrialização e conse- quente exploração dos recursos naturais, uma quantida- de muito grande de resíduos tem se acumulado no meio ambiente. Além de representar perdas de matéria-prima e energia, esses resíduos exigem investimentos significati- vos em tratamentos para controlar os efeitos da sua dispo- sição no ambiente. Diversas formas de reaproveitamento de resíduos para a geração de energia ou de produtos de maior valor agregado têm sido estudadas, numa tentativa de minimizar os prejuízos ambientais e econômicos deles decorrentes (LIGUORI; AMORE; FARACO, 2013; MIRABEL- LA; CASTELLANI; SALA, 2014; SHEN; ZHAO; SHAO, 2014). A composição dos resíduos é variável, podendo ser majoritariamente orgânica ou inorgânica. Resíduos orgânicos podem ser aproveitados em processos fer- mentativos, nos quais são utilizados como substratos para a geração de produtos com maior valor agregado como enzimas, ácidos, biopolímeros e antibióticos (LI- GUORI; AMORE; FARACO, 2013). A vantagem está na alta disponibilidade e no baixo custo. Como exemplos de resíduos aproveitados em fermentação na indústria podem ser citados o soro de leite e a água de mace- ração de milho (LADEIRA et al., 2012; NASCIMENTO & MARTINS, 2006; TONI; IAMAMURA; DORTA, 2012). Grandes quantidades de glicerina são formadas na pro- dução de biodiesel (em torno de 10 m3 de glicerina para cada 90 m3 de biodiesel) (MOTA; SILVA; GONÇALVES, 2009; SINGHABHANDHU & TEZUKA, 2010), resultando em impactos econômicos e ambientais que se agra- vam com a crescente demanda pelo biocombustível. Dada a importância do assunto, é crescente o número de trabalhos sobre o reaproveitamento desse resíduo (MOTA; SILVA; GONÇALVES, 2009). A glicerina contém de 50 a 60% de glicerol e outros com- ponentes resultantes do processo (SINGHABHANDHU & TEZUKA, 2010). Uma possibilidade de estudo é o apro- veitamento do glicerol da glicerina como substrato para a obtenção de substâncias de maior valor agregado pela ação de microrganismos em processos fermentativos. Alguns produtos que podem ser assim obtidos são o ácido cítrico por Yarrowia lipolytica (SILVA et al., 2010), o 1,3-propanodiol por Clostridium butyricum (PAPANI- KOLAOU et al., 2000), a dihidroxiacetona por Schizochy- trium limacinum (SONG et al., 2007) e o etanol por Kleb- siella variicola (SUZUKI et al., 2014). Um dos impasses é a presença de impurezas na glicerina, que podem inibir o microrganismo produtor (ALMEIDA, 2011; DOBSON; GRAY; RUMBOLD, 2012). Um grande desafio é a obten- ção de linhagens microbianas que sejam tolerantes a es- sas impurezas (SUZUKI et al., 2014; ALMEIDA, 2011; ITO et al., 2005). A composição da glicerina pode variar, entre outros aspectos, de acordo com a matéria-prima utilizada na produção do biodiesel. A principal matéria-prima des- sa produção são os óleos vegetais de oleaginosas como a soja, o girassol e a canola. A produção dos óleos para esse fim depende da disponibilidade de terras para cul- tivo e tem sido criticada pelo uso da terra para produzir insumos não alimentícios. Uma forma de mitigar esses impasses é utilizar, na produção de biodiesel, óleo de cozinha residual (OCR) ou de fritura, um passivo am- biental com potencial superior a 30 mil toneladas por ano no Brasil (MOURA, 2010). As principais vantagens da utilização de OCR são a diminuição do custo pela eliminação da etapa de extração do óleo e com a ma- téria-prima, por se tratar de um resíduo, além da dimi- nuição da poluição do solo e do lençol freático pelo não descarte do óleo na natureza (MOURA, 2010; ARAÚJO et al., 2013). É importante o apoio do governo e da ini- ciativa privada na coleta do óleo. Já existem postos de coleta de óleo de fritura no estado do Rio de Janeiro (GOVERNO DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO, s.d.). Aspergillus niger é um dos mais importantes micror- ganismos na biotecnologia, já bastante empregado industrialmente. Esse fungo vem sendo utilizado por várias décadas para produzir enzimas e ácido cítri- co a partir de diferentes matérias-primas, inclusive resíduos (LIGUORI; AMORE; FARACO, 2013; ANDRÉ et al., 2010; DESGRANGES & DURAND, 1990; LEGISA & MATTEY, 1986; VENEGAS et al., 2013). É um fungo considerado não patogênico, podendo ser usado in- clusive na indústria alimentícia, pois somente uma pequeníssima porcentagem das linhagens dessa es- pécie apresenta produção de toxinas (ANDRÉ et al., 2010; SCHUSTER et al., 2002). O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial da uti- lização de glicerina residual do biodiesel de óleo de fri- tura sem purificação como fonte de carbono e energia para o fungo Aspergillus niger. Victorino, T.R.; Pereira, R.G.; Fiaux, S.B. 58 RBCIAMB | n.42 | dez 2016 | 56-66 MATERIAL E MÉTODOS Óleo de cozinha residual Procedência O OCR foi cedido pelo Auto Posto Ingá, localizado em Niterói, Rio de Janeiro, que faz parte do Projeto Posto Cidadão, monitorado pela Secretaria Municipal de Meio Ambiente de Niterói. É um óleo de cozinha já utilizado, proveniente das casas dos moradores da região e de res- taurantes que o utilizaram na fritura de alimentos. Composição em ácidos graxos A composição em ácidos graxos foi analisada por cro- matografia gasosa acoplada a espectrômetro de mas- sas. A amostra para injeção foi preparada a partir de aproximadamente 370 mg do material lipídico, aos quais foram adicionados 5 mL de solução metanólica de hidróxido de sódio 0,5 M, seguindo-se um aqueci- mento à ebulição sob refluxo por 3 a 5 minutos. À so- lução quente foram adicionados 15 mL do reagente de esterificação (cloreto de amônio e ácido sulfúrico con- centrado em metanol), retornando-se ao refluxo por mais 3 minutos. Depois do resfriamento, a mistura foi colocada em funil de decantação e foram acrescenta- dos 50 mL de água destilada e 25 mL de hexano para cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Após a separação, a fase hexânica foi filtrada em presença de sulfato de sódio anidro. O extrato hexânico foi coloca- do em tubo lacrado e mantido congelado até a análise cromatográfica (SANTOS, 2010). A cromatografia foi realizada em cromatógrafo (Shima- dzu, modelo QP2010) equipado com detector de espec- trometria de massas e coluna capilar de sílica fundida com fase 5% difenil/95% dimetil-polisiloxano, modelo RTX-5MS, com 30 m de comprimento, 0,25 mm de diâ- metro e 0,25 μm de espessura. O gás de arraste foi o hé- lio, com fluxo de 0,76 mL.minuto-1. A temperatura inicial da coluna foi de 120°C, sendo mantida por 4 minutos e depois elevada até 230°C a uma taxa de 1°C.min-1, per- manecendo a 230°C por 3 minutos. O tempo total da cor- rida foi de 117 minutos. A temperatura da fonte de íons, do injetor e da interface foi de 250°C. O modo de injeção foi split (taxa de Split 1:50) e o intervalo de m/z foi de 40,00 a 500,00. A quantidade de amostra injetada foi de 1 μL diluída em hexano. Os diferentes ácidos graxos foram identificados por comparação dos seus espectros de massas com os espectros de padrões pertencentes à biblioteca do equipamento. Determinação da viscosidade dinâmica e da viscosidade cinemática do óleo de cozinha residual Duas análises foram realizadas em reômetro (RS 50 RheoStress/Precitech Instrumental LTDA) para a deter- minação da viscosidade dinâmica: uma à temperatura constante de 40°C e a outra variando entre 25 e 90°C. A viscosidade cinemática foi determinada em viscosí- metro cinemático tipo Cannon-Fenske, também a 40°C. Obtenção da glicerina: reação de transesterificação para produção de biodiesel Hidróxido de sódio foi dissolvido em álcool etílico na proporção de 1% (m.v-1) em Erlenmeyer com o auxílio de um agitador magnético. O frasco foi mantido ve- dado para evitar a evaporação do álcool e a absorção de umidade do ar. Após a dissolução total do hidróxi- do de potássio (catalisador), óleo de fritura (filtrado e seco a 110°C por uma hora) foi adicionado à solução lentamente sob agitação, numa relação de volume de álcool e de óleo de 2:5, até a mistura completa. O con- junto foi colocado em ultrasom (Hielscher UP 200S Ul- trasonic Processor Ultrasound Tecnology) com ampli- tude de 60% por 15 minutos, para a reação. Após esse tempo, a mistura foi mantida em funil de separação por um dia para a separação das fases. A glicerina (fase pesada), de cor castanho-escura, foi transferida para um frasco e armazenada à temperatura ambien- te até o momento do uso. Aproveitamento da glicerina de biodiesel obtida a partir de óleo de fritura para o cultivo do fungo aspergillus niger 59 RBCIAMB | n.42 | dez 2016 | 56-66 Ensaios com a glicerina Microrganismo, meio de cultivo e inoculação Foi utilizado o fungo filamentoso Aspergillus niger IN- CQS 40065, gentilmente cedido pelo Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (INCQS) da Fun- dação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ). O microrganismo foi conservado em solo estéril à temperatura ambiente. O meio de cultivo para o experimento teve a seguin- te composição em (g.L-1): (NH4)2SO4, 5,0; KH2PO4, 1,0; MgSO 4 .7H 2 O, 0,25 e (em mg.L-1): Fe+2 (como FeSO 4 .7H 2 O), 0,3; Zn+2 (como ZnSO 4 .7H 2 O), 0,4; Mn+2 (como MnSO 4 . H 2 O), 0,15; Cu+2 (como CuSO 4 .5H 2 O), 0,4; pH 5,0, acres- cido da fonte de carbono e esterilizado a 121°C por 15 minutos. A inoculação foi feita a partir de esporos previamente obtidos em meio batata dextrose (BDA). Os esporos foram suspensos com solução 0,1% de Tween 80, e a concentração foi determinada por con- tagem em câmara de Neubauer. Volume suficiente da suspensão de esporos foi transferido para o meio de cultivo, de forma que a concentração final no meio fos- se 105 esporos.mL-1. Crescimento do microrganismo O experimento foi realizado em Erlenmeyers de 250 mL contendo 50 mL de meio de cultivo. Foram utilizados como fontes de carbono a glicerina do biodiesel obtida neste trabalho, a sacarose PA e o glicerol PA adiciona- dos ao meio de cultivo na concentração de 40,5; 51,1 e 47,5 g.L-1, respectivamente. A sacarose e o glicerol PA foram utilizados como controles. A glicerina foi usada sem purificação, e os Erlenmeyers foram incubados a 30°C e sob agitação de 150 rpm em shaker (Marconi, modelo MA 830/400) por 5 dias. As amostragens, cons- tituídas do conteúdo total do frasco, foram feitas em duplicata. A concentração celular foi determinada pelo método do peso seco de células, secando-se o micélio a 80°C por 24 h, após separação do meio por filtração em papel de filtro seco e tarado e lavagem com água. O pH foi determinado no meio após filtração, utilizan- do-se pHmetro. RESULTADOS E DISCUSSÃO Óleo de cozinha residual O OCR utilizado no estudo apresentou coloração ama- relo-escura e sólidos em suspensão, que foram separa- dos por filtração. O óleo foi seco antes da reação, pois a umidade nele presente poderia interferir ou gerar formação de sabão, o que dificultaria a separação pos- terior dos produtos (ARAÚJO et al., 2013). Uma análise qualitativa da composição do triglicerídeo presente no OCR foi realizada por cromatografia gasosa para verifi- car a qualidade do óleo de fritura utilizado. O Quadro 1 mostra a identificação dos ácidos graxos correspon- dentes a cada pico obtido na análise cromatográfica do OCR e suas estruturas moleculares. Ainda com a mes- ma intenção, a viscosidade cinemática e a viscosidade dinâmica foram determinadas. A composição de ácidos graxos do OCR mostrou-se bastante parecida com a dos óleos de soja, algodão, coco, sebo bovino e banha encontrada em relatos da literatura (CHRISTOFF, 2007; FANGRUI & MILFORD, 1999; ZHENZHONG et al., 2010). A viscosidade dinâmica a 40°C foi de 0,038 Pa.s, numa faixa de taxa de cisalhamento de 0 a 70 s-1. Foi obser- vado, também, decréscimo da viscosidade dinâmi- ca com o aumento da temperatura, sendo o valor da viscosidade a 25°C igual a 0,06593 Pa.s e a 84°C, igual a 0,0115 Pa.s. A viscosidade cinemática determinada a 40°C foi de 36,87 cSt, próxima à encontrada no traba- lho de Moura (2010), a 40°C. Os resultados também são bem próximos daqueles obtidos para os óleos de pinhão manso, canola e soja (ARJUN; WATTS; RAFIQUL, 2008; BOFFITO et al., 2013; PARASCHIV; TAZEROUT; KUNCSER, 2008). A deterioração do óleo durante a fritura pode tra- zer problemas à reação de transesterificação e ge- rar produtos indesejáveis (ARAÚJO et al., 2013), o Victorino, T.R.; Pereira, R.G.; Fiaux, S.B. 60 RBCIAMB | n.42 | dez 2016 | 56-66 Tempo de retenção (minutos) Nome dos ácidos graxos Fórmula molecular Estrutura molecular 33,7 Mirístico C 15 H 30 O 2 49,4 Palmitoleico C 15 H 30 O 2 51,6 Palmítico C 17 H 34 O 2 66,3 Linoleico C 19 H 34 O 2 66,9 Elaidico C 19 H 36 O 2 67,2 Oleico C 19 H 36 O 2 67,4 12-cis-octadecadienoato C 19 H 34 O 2 67,9 Linolênico C 19 H 32 O 2 69,1 Esteárico C 19 H 38 O 2 83,3 13-cis-eicosenóico C 19 H 36 O 2 85,7 Araquídico C 21 H 42 O 2 101,2 Behênico C 23 H 46 O 2 Quadro 1 – Ácidos graxos do óleo de cozinha residual identificados por análise em cromatógrafo gasoso acoplado a espectrômetro de massas. Aproveitamento da glicerina de biodiesel obtida a partir de óleo de fritura para o cultivo do fungo aspergillus niger 61 RBCIAMB | n.42 | dez 2016 | 56-66 que pode resultar em um biodiesel e a respectiva glicerina de baixa qualidade. A qualidade da gliceri- na a ser utilizada como matéria-prima no processo biotecnológico pode influenciar na adaptação do microrganismo ao meio de cultivo e na qualidade do produto obtido (SAMUL; LEJA; GRAJEK, 2014). Pelas análises de composição, viscosidade dinâmica e viscosidade cinemática, o óleo de fritura utilizado no presente projeto apresentou boa qualidade para o uso pretendido. Obtenção da glicerina A reação de transesterificação utilizando OCR resul- tou em 13% de glicerina, índice comparável com o tra- dicionalmente relatado (MOTA; SILVA; GONÇALVES, 2009; SINGHABHANDHU & TEZUKA, 2010). Esse bom resultado corrobora a qualidade do OCR anterior- mente verificada. A glicerina apresentou coloração castanho-escura. O teor de glicerol foi de aproxima- damente 30% (m.m-1), resultado menor do que o que tem sido relatado na literatura (SINGHABHANDHU & TEZUKA, 2010). Utilização da glicerina de biodiesel de óleo por Aspergillus niger O meio de cultivo apresentou uma camada superficial de material oleoso após a esterilização. Provavelmen- te os ácidos graxos residuais resultantes da reação de transesterificação, que não são solúveis em água, sol- vente utilizado em meios de cultivo, formaram essa camada. Na primeira amostragem do meio com gli- cerina do biodiesel (24 horas de cultivo), essa fase oleosa era muito aparente e permaneceu em parte com a biomassa. Para que não houvesse alteração na determinação da concentração celular, a biomassa foi lavada com 15 mL de hexano, de forma a solubilizar o óleo, após a filtração do meio de cultivo. Nos demais tempos esse procedimento não foi necessário, pois a camada de óleo desapareceu do meio, provavelmen- te consumida pelo microrganismo. A sacarose e o glicerol foram utilizados como fonte de carbono em experimentos controle. A primeira, por ser uma fonte de carbono bastante utilizada para o cresci- mento de A. niger, inclusive industrialmente; o segundo, por ser o principal componente da glicerina do biodie- sel. O crescimento celular obtido a partir de aproxima- damente a mesma concentração em massa de cada fon- te de carbono utilizada está apresentado na Figura 1. A. niger apresentou bom crescimento na presença de todas as fontes de carbono. As taxas de crescimento nos meios contendo sacarose e glicerina foram simila- res e maiores do que as observadas em meio conten- do glicerol. A concentração máxima de biomassa foi obtida em 150 horas, sendo a maior obtida em meio contendo glicerina como fonte de carbono (22,8 g.L-1). Essa foi 5% maior do que a obtida em sacarose e 27% maior do que a obtida em glicerol PA. Mesmo não tendo sido feito pré-tratamento na gliceri- na do biodiesel, as impurezas presentes não afetaram o crescimento do fungo, ao contrário do que tem sido relatado para outros microrganismos (PYLE; GARCIA; WEN, 2008; ATHALYE; GARCIA; WEN, 2009). Aparente- mente, alguns resíduos da reação de produção do bio- diesel, como os resíduos de triglicerídeos (óleo de fri- tura utilizado) ou de ácidos graxos livres, contribuíram para o crescimento de A. niger. Essa afirmativa pode ser verificada por meio da comparação entre o cres- cimento em glicerol PA e o crescimento em glicerina. Papanikolaou et al. utilizaram OCR para gerar biomassa de algumas linhagens de Aspergillus, o que constitui um indicativo da possível contribuição desse resíduo para o crescimento microbiano na glicerina do biodie- sel (PAPANIKOLAOU et al., 2011). O pH do meio de cultivo decresceu até aproximada- mente 70 horas, mantendo-se estável após esse tem- po em 2,0 e 1,5 no meio com glicerina e no meio com sacarose, respectivamente. Embora o pH nesses meios tenha se estabilizado em 70 horas, o fungo continuou a crescer até o final do experimento. No meio com glice- rol, o pH decresceu até 1,5 no tempo total de cultivo, o mesmo valor final do meio com sacarose. A morfologia do micélio também apresentou diferença de acordo com o meio. No meio de cultivo contendo sacarose, A. niger se apresentou na forma de pellets bem formados; nos meios contendo glicerol e glicerina de biodiesel, o micélio se apresentou mais fragmenta- do (Figura 2). Victorino, T.R.; Pereira, R.G.; Fiaux, S.B. 62 RBCIAMB | n.42 | dez 2016 | 56-66 Figura 1 – Concentração celular e pH em função do tempo de cultivo em meio contendo sacarose PA, 51,1 g.L-1 (♦, ◊), glicerol PA, 47,5 g.L-1 (■, □) e glicerina de biodiesel, 40,5 g.L-1 (▲, Δ). Co nc en tr aç ão c el ul ar (g .L -1 ) Tempo de cultivo (h) pH d o m ei o de c ul tiv o 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 100500 150 Figura 2 – Morfologia dos pellets de Aspergillus niger nos três diferentes meios: (A) sacarose; (B) glicerol; (C) glicerina de biodiesel. A B C Aproveitamento da glicerina de biodiesel obtida a partir de óleo de fritura para o cultivo do fungo aspergillus niger 63 RBCIAMB | n.42 | dez 2016 | 56-66 A glicerina de biodiesel obtida a partir de OCR, sem nenhuma purificação, foi utilizada com sucesso para o crescimento de A. niger. Esse fato mostra o seu poten- cial de reaproveitamento em bioprocessos utilizando esse fungo, com diminuição dos impactos econômicos e ambientais da geração tanto desse resíduo quanto do OCR. Não foi necessária purificação prévia da glicerina para o cultivo, fato que valoriza ainda mais a aplicação, pois evita os custos decorrentes da purificação. As poucas pesquisas feitas sobre o cultivo de A. niger utilizando glicerina de biodiesel como fonte de car- bono mostram seu grande potencial para a obtenção de substâncias de interesse. É conhecido que A. niger, pelo seu desenvolvimento em meio apropriado, leva à formação de vários ácidos orgânicos, a depender das condições de cultivo (LIGUORI; AMORE; FARACO, 2013; STEIGER et al., 2013). A formação de ácido oxá- lico já foi observada em meio contendo glicerina de biodiesel obtida a partir de óleos comerciais (ANDRÉ et al., 2010). Há relatos da utilização do meio de cul- tivo enriquecido com esse ácido, resultante da ação de A. niger sobre a glicerina de biodiesel em condi- ções apropriadas, para o branqueamento de caulim (MUSIAL; CIBIS; RYMOWICZ, 2011). A glicerina de bio- diesel também já foi utilizada como complemento ao meio sólido na produção de ácido cítrico por A. niger a partir de torta de tungue (SCHNEIDER et al., 2014). A redução do pH no presente estudo mostra que é possível obter ácidos a partir de glicerina de óleo de fritura sem prévia purificação. Também são encontrados estudos de aplicação da glicerina em cultivos de A. niger para a obtenção de lipídeos microbianos, chamados de single cell oil (ANDRÉ et al., 2010; PAPANIKOLAOU et al., 2011). Esses podem servir de fonte de ácidos graxos importantes para a indústria farmacêutica, mas recentemente ganha- ram espaço como matéria-prima potencial para a produ- ção de biodiesel (PAPANIKOLAOU et al., 2008). Os lipídeos são extraídos diretamente do micélio. Em A. niger cresci- do em glicerina, a maior proporção de lipídeos em rela- ção à biomassa foi obtida no início da fase estacionária de crescimento (ANDRÉ et al., 2010). André et al. (2010), estudando a produção de lipídeos, obtiveram crescimen- to de A. niger entre 6 e 8 g.L-1 a partir de até 60 g.L-1 de gli- cerina purificada — 70% em glicerol (m.m-1). No presente estudo foi possível obter mais de 20 g.L-1 de biomassa a partir de glicerina sem purificação, um grande potencial para a obtenção de lipídeos, considerando-se que eles são proporcionais à biomassa no início da fase estacioná- ria de crescimento. Também podem ser citadas como produtos potenciais para o cultivo de A. niger, embora ainda não tenham sido verificadas em glicerina de biodiesel, a vanilina e as lipases (LIGUORI; AMORE; FARACO, 2013; PAPANI- KOLAOU et al., 2008; 2011; SALIHU et al., 2012). A carência de estudos sobre o desenvolvimento de A. niger em meios contendo glicerina de biodiesel ain- da é grande. As poucas pesquisas encontradas utiliza- ram glicerina purificada e com teor de glicerol próximo a 70%. O presente estudo mostrou que mesmo gliceri- nas obtidas a partir de matérias-primas residuais como o OCR e contendo baixo teor de glicerol (30%) podem ser utilizadas com vantagem, sem purificação prévia para o cultivo de A. niger. A possibilidade do uso de glicerina sem purificação tem como boa consequência a diminuição dos custos do processo. Espera-se que a exploração desse potencial tenha sido estimulada pe- los resultados aqui apresentados. CONCLUSÕES O estudo mostrou que a glicerina subproduto do bio- diesel obtido de OCR é uma matéria-prima apropria- da para processos biotecnológicos utilizando o fungo Aspergillus niger. Essa matéria-prima proporcionou crescimento ligeiramente maior do fungo do que a sacarose, substrato geralmente utilizado em biopro- cessos com Aspergillus niger, e substancialmente maior do que o glicerol, principal componente da gli- cerina de biodiesel. As impurezas presentes na glice- rina do biodiesel de OCR não inibiram o crescimento do microrganismo, mas, ao contrário, parecem ter influenciado positivamente em seu desenvolvimento. Mais ainda, a aplicação da glicerina obtida a partir da transesterificação de OCR reduz o impacto ambiental e econômico ao utilizar dois passivos: a própria glice- rina e o OCR. Produtos que podem ser citados para a produção por A. niger a partir da glicerina do biodie- sel de OCR são: ácido oxálico, lipídeos, lipases, vanili- na, ácido cítrico e solução ácida para branqueamento de minerais industriais. Victorino, T.R.; Pereira, R.G.; Fiaux, S.B. 64 RBCIAMB | n.42 | dez 2016 | 56-66 REFERÊNCIAS ALMEIDA, J. R. M. Microrganismos para produção de químicos a partir da glicerina bruta gerada na produção de biodiesel. Circular Técnica Embrapa, n. 7, 2011. ANDRÉ, A.; DIAMANTOPOULOUB, P.; PHILIPPOUSSISB, A.; SARRISA, D.; KOMAITISA, M.; PAPANIKOLAOUA, S. Biotechnological conversions of bio-diesel derived waste glycerol into added-value compounds by higher fungi: production of biomass, single cell oil and oxalic acid. Industrial Crops and Products, v. 31, p. 407-416, 2010. ARAÚJO, C. D. 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