1 INTRODUCTION Wound healing is an active area of research on accounts of its importance in the treatment of burns, prevention of post surgical adhesions and cosmetics surgery (Risbud et al., 2000). The purpose served by dressing  includes  protecting  wounds,  promoting healing, and providing, retaining or removing moisture ~ Synthesis of Polyvinyl Alcohol-Chitosan Hydrogel and Study .......... (T. Wikanta, Erizal, Tjahyono, and Sugiyono) SYNTHESIS OF POLYVINYL ALCOHOL-CHITOSAN HYDROGEL AND STUDY OF ITS SWELLING AND ANTIBACTERIAL PROPERTIES Sintesis Hidrogel Polivinil Alkohol-Kitosan dan Studi Sifat Mengembang dan Antibakterinya Thamrin Wikanta1), Erizal2), Tjahyono2) and Sugiyono1) 1)Research  and  Development  Center  for  Marine  and  Fisheries  Product  Processing  and  Biotechnology 2)Center  for  the Application  Isotopes  and  Radiation  Technology,  Jl.  Lebak  Bulus  Raya  No.49.  Jakarta  Selatan *Correspondence Author:  Thamrin  W ikanta,  KS.  Tubun  Petamburan  VI  Jakarta  Pusat  10260,  E-mail:  thamrin_wikanta@yahoo.com ABSTRACT The aim of this research was to synthesize a hydrogel for wound dressing by mixing of polyvinyl alcohol  (PVA)  and  chitosan  (CTS)  and  processed  by  combination  technique  of  freezing-thawing and  irradiation  by  gamma ray, and to study  of  its  properties. PVA aqueous  solution  10%  (w/v) was mixed  with  2%  (w/v)  chitosan  (CTS)  solution  and  homogenized.  The  PVA-CTS  mixture  was processed  by  freezing-thawing  up  to  3  cycles,  and  then  irradiated  by  gamma  rays  at  the  dose ranged of 20-50 kGy  (dose rate was 10 kGy/hour). Result showed that PVA-CTS hydrogel with the gel fraction of 83%, 87%, 90%, and 83% were obtained at the irradiation dose of 20 kGy, 30 kGy, 40 kGy, and  50  kGy, respectively. Increasing of irradiation dose caused increasing  of water absorption of hydrogel, i.e. 1.700 %, 1.715  %, 1.913  %, and 2.036  %, respectively, and  the hydrogel reached the  equilibrium  in  25  hours.  The  hydrogel  showed  very  slow  water  evaporation  rate  (~  2%)  at  the initial time  (1  hour)  and  then  increased very  fast (up  ~50  %)  at 24  h,  i.e.  43%,  39.13%,  44%, and 53%,  respectively.  The  elongation  at  break  of  hydrogels  were  obtained  245%,  322%,  322%,  and 205% with the maximum value were obtained at irradiation dose ranged of 30-40 kGy. The presence of  chitosan  in  the  PVA  hydrogel  made  it  having  higher  antibacterial  properties  with  the  inhibition zone  value  of  8  mm  at  irradiation  dose  of  30-40  kGy  compared  to  PVA  hydrogel  as  a  negative control  (6  mm)  and  to  chloramphenicol  as  a  positive  control  (8  mm). Keywords: hydrogel, polyvinyl alcohol (PVA), Chitosan (CTS), freezing-thawing, gamma irradiation ABSTRAK T uj u an   d ari  pen elitian   in i  adalah   men sintesis  h idro gel  u ntu k  p em balut  lu k a  den gan mencampurkan  polivinil  alkohol  (PVA)  dan  kitosan  (CTS)  dan  diproses  dengan  kombinasi  teknik beku-leleh  dan  irradiasi  sinar  gamma,  serta  mempelajari  sifat-sifatnya.  Larutan  PVA  10%  (b/v) dicampur dengan 2% (b/v) larutan kitosan (CTS) dan dihomogenkan. Campuran PVA-CTS diproses dengan  beku-leleh  hingga  3  siklus,  dan  kemudian  diirradiasi  dengan  sinar  gamma  pada  kisaran dosis  20-50  kGy    (laju  dosis  adalah  10  kGy/jam).  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  hidrogel PVA-CTS  dengan  fraksi  gel  83%,  87%,  90%,  dan  83%  didapatkan  pada  dosis  irradiasi  masing- masing  20  kGy,  30  kGy,  40  kGy,  and  50  kGy.  Meningkatnya  dosis  irradiasi  mengakibatkan meningkatnya  absorpsi  air  oleh  hidrogel,  yaitu  masing-masing  1.700  %,  1.715  %,  1.913  %,  dan 2.036  %,  dan  hidrogel  mencapai  kondisi  keseimbangan  dalam  25  jam.  Hidrogel  menunjukkan laju  penguapan  air  sangat  lambat  (~  2%)  pada  awal  waktu  (1  jam)  dan  selanjutnya  meningkat dengan sangat cepat (hingga ~50 %) pada 24  jam, yaitu masing-masing 43%,  39.13%, 44%, dan 53%.  Nilai  perpanjangan  putus  dari  hidrogel  didapatkan  245%,  322%,  322%,  dan  205%  dengan nilai  maksimum  didapatkan  pada  dosis  irradiasi  berkisar  30-40  kGy.  Adanya  kitosan  dalam hidrogel  PVA  menjadikannya  memiliki  sifat  antibakteri  lebih  tinggi  dengan  nilai  zona  inhibisi  8 mm  pada  dosis  irradiasi  30-40  kGy  dibandingkan  dengan  hidrogel  PVA  sebagai  kontrol  negatif  (6 mm)  dan  dengan  kloramfenikol  sebagai  kontrol  positif  (8  mm). Kata Kunci: hidrogel, polivinil alkohol (PVA), kitosan (CTS), beku-leleh, irradiasi gamma ~ 2 (Park &  Barbul,  2004). Hydrogels  are  cross-linked hydrophilic  polymer  networks  which  absorb  large amounts  of  water.  Hydrogel  wound  dressing  has humectants properties such that the wound is kept hydrated to prevent any scabbing  or drying out so that the wound is allowed to heal from inside out. The absorption of secretion causes an expansion of the hydrogel making room for the inclusion of foreign bodies such as bacteria detritus and odor molecules that are irreversibly taken up along the liquid (Pai et al., 2006). Based on their similar physical properties to human tissues  and  their  excellent  tissue  compatibility, hydrogels have been studied extensively for biomedical applications. They can be used as soft contact lenses (Dillehay & Miller, 2007; Cheng et al., 2004), tissue engineering scaffold (Seng et al., 2012), controlled drug-release vehicles (Barndl et al., 2010) and wound dressings (Wang et al., 2012). Hydrogels have many advantages as wound dressings, for instance, absorb excess of wound exudates, protect the wound from secondary infection and effectively promote the healing process by providing a moisturized wound healing environment.  They  also  can  be  removed  without causing trauma to the wound (Thomas, 2007). Polyv inyl  alcohol  (PVA)  is  a  water-soluble polyhydroxy polymer. It has been used in practical applications because of its easy preparation, chemical resistance and physical properties, biodegradable, and cheap (Anon., 2006; Stasko et al., 2009). Chitosan (CTS), partially deacetylated of chitin, is a well known material in the wound dressing field. It has an excellent antibacterial activity, biodegradability, hemostatic, and biocompatibility (Goosen, 1997; Tombs & Harding, 1998; Liu et al., 2001; Panos et al., 2008). The use of chitosan as an additive in hydrogels can improve its performance for wound dressing. Chemical structure of PVA and CTS are presented in Fig. 1. Hydrogels can be prepared by irradiation, freezing- thawing or chemical methods. Irradiation is considered to be a suitable tool for the formation of hydrogel. The main disadvantage of hydrogel prepared by irradiation is  their  poor  mechanical  strength.  In  addition,  the technique is easy control of processing, no necessity to add any initiators or cross-linkers which may be harmful and difficult to remove, and possesses the possibility  of  combining  hydrogels  formation  and sterilization in one technological step. Hydrogels of PVA in aqueous solutions prepared by freezing-thawing have shown many interesting properties (Stasko et al., 2009). The main disadvantages of this hydrogel are its opaque appearance and the limited swelling capacity  and  thermal  stability.  They  have  good mechanical strength, stable at room temperature, and with no initiators or cross-linkers. Up  to  date,  much  work  hav e  been  done  on preparing hydrogels by irradiation (Erizal & Chosdu, 2009;  Erizal  et al.,  2011)  or  by  freezing-thawing (Lopergolo et al., 2002; Nugent et al., 2005; Zhao et al., 2003; Bajpai & Saini, 2005). However,  there is very little information on preparation of hydrogels by combining  the  two  processing  techniques  (Nho  & Park, 2002; Erizal et al., 2011), especially by freezing- thawing followed by irradiation. In  this  research,  PVA  hydrogels  containing chitosan was prepared by combination technique of freezing-thawing and followed by γ-irradiation. The properties of the hydrogel including the gel fraction, the water absorption, the water evaporation rate, and the antibacterial properties were investigated. Figure 1. Repetitive units on the chemical structure of chitosan and polyvinyl alcohol.                 A= D-glucosamine; and B = N-acetyl-D-glucosamine; P = Polyvinyl alcohol. A                                                                                      B A= D-glucosamine B = N-acetyl-D-glucosamine;  Squalen Vol. 7 No. 1, May 2012: 1-10. 3 MATERIAL AND METHOD Materials Polivinyl alcohol (PVA) with molecular weight of 72000 was purchased from Merck and used without any pretreatment. Chitosan (CTS) was purchased from Bi o tech  Suri n do,  I ndone si a  wi th  d egree   of deacetylation of 92 %.  Acetic acid was purchased from Merck. All chemicals were of analytical grade and distilled water was obtained in our lab using aqua distilator. The 7 (seven) species of bacteria indicator namely Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Pseudomonas aerouginosa, Streptococcus sp., Bacillus stearothermophillus, and Bacillus subtilis were  obtained  from  collection  of bacteri a  cul ture  l aboratory  at  Research  and Development Center for Marine and Fisheries Product Processing and Biotechnology. Preparation of PVA-CTS Hydrogel A  10%  (w/v)  of  PVA  solution  was  prepared  by dissolving PVA in distilled water and autoclaving at 121oC for 20 minutes. A 2% (w/v) of chitosan solution was prepared by dissolving chitosan in 1% acetic acid sol u ti on.  B oth  of   sol uti ons  wer e  m i x ed   and homogenized by stirring at room temperature to get the final volume of 500 mL. The mixture was poured into polyethylene plastic bags, dimension  of (20 cm x 10 cm x 0.5 cm), sealed and kept it in freezer at - 80oC for 2 hours, then was thawed at room temperature for 1  h (  this is called  as 1  cycle).  The  process of freezing-thawing was repeated for 3 cycles. Finally, all the samples were irradiated by gamma rays from 60Co source at the doses of 20 kGy, 30 kGy, 40 kGy, and 50 kGy  (dose rate: 10 kGy/h) at room temperature. The hydrogels were washed directly for gel fraction determination  and  the  rest  were  used  for  swelling studies. Each treatment was done in triplicate. Gel Fraction The hydrogel samples (2 cm x 2 cm x 0.5 cm) were put in the glass cup containing excess distilled water and were taken into shaker incubator at room temperature for 24 h, to remove the soluble fraction. The gels were dried under vacuum to constant weight. The insoluble fraction in the samples was determined gravimetrically and calculated as follow: Gel Fraction (%) = (W 2 /W 1 ) x 100% where W 1   is the initial weight of the gel and W 2  is the weight of dry gel after extraction. Water Absorption The water absorption of hydrogel was determined by  gravimetric  method. The  gel  samples  (dried to constant  weight)  were  immersed  in  a  glass  cup containing excess distilled water at room temperature. The hydrogel were periodically weighed after the water on the gel surface was removed with a filter paper. The water absorption was calculated as follow: Water absorption = {(Ws-Wd)/Wd} x 100% where Ws   is the weight of the swollen gels at time t and Wd is the initial weight of dried gels. Elongation at Break Elongation  at  break  is  an  important  physical parameter of hydrogel representing its elasticity, and measured based on ASTM standard method by using Instron tester instrument. The hydrogels were moulded with dumbbell for the preparation of the standard size measurement. Both ends of the pieces were firmly clamped in the jaws of a testing machine. One jaw was fixed and the other was movable. The movable jaw  moved  at  the  rate  of  30  mm/min  at  room temperature. The resultant data was showed at the recorder. This procedure was repeated for three times for each result. The elongation at break was calculated as follow: Elongation at break = L 1 /L o    X 100% Where L o  is the initial length and L 1  is the final length. Antibacterial Assay Antibacterial activity of PVA-CTS hydrogels were tested using Kirby-Bauer method (Rollins & Joseph, 2000) against seven species bacteria, Escherichia coli (E. col i), S taph yloco ccus aure us, B acil lus stearothermophilus, Salmonella typhimurium, Streptococcus sp., Pseudomonas aeroginosa, Bacillus subtilis. As a negative control was disc blank (PVA  hydrogel   disc),  a  positi v e  control   was chloramphenicol  (PVA  hydrogel  disc  +  100  ppm chloramphenicol),  and  a  treatment  was  PVA-CTS hydrogel disc. At amount of 15 mL agar Mueller Hinton was poured into 90 mm petridish until solidification. At about 105 CFU/mL microbial culture suspension was spread over the surface of a sterile agar plate evenly by a sterile swab, then added another 15 mL agar  solution,  homogenized  and  waited  at  room temperature  until  the  plates  cooled  down.  The hydrogels treatment and control were applied on the centre of plates and the mixture was kept at 37°C for 48 hour. The antibacterial inhibition of hydrogel was Synthesis of Polyvinyl Alcohol-Chitosan Hydrogel and Study .......... (T. Wikanta, Erizal, Tjahyono, and Sugiyono) 4 irradiation H2O H*, HO*, H2O2 (1) P P* + H* (2) P + H* P* + H2 (3) P + OH* P* + H2O (4) P + P P – P (crosslinking) (5) When air is present, the expected reaction is assumed to be: H* + O2 HO2* (6) P* + O2 POO* (7) POO* + HO2* C + H2O2 + O2 (8) O C degradation (9) O O* P + HO2* PO*( CH2 C CH2 ) + H2O (10) OH O* O CH2 C CH2 CH2 C + *CH2 (degradation) (11) OH OH Figure 2. Effect of Gamma irradiation on polyvinyl alcohol polymer in aqueous solution, crosslinking and degradation reaction (Sakurada & Ikada, 1963). CH2 CH Polyvinyl alcohol n OH + Chitosan + Irradiation CH2 CH CH 2 C* Radical n n O* OH OH CH 2 CH CH 2 C Crosslinking n-m m O O CH 2 C CH2 CH n-m m OH Chitosan (CTS)  Polyvinyl alcohol (PVA) Figure 3. Effect of gamma irradiation on polyvinyl alcohol polymer in aqueous solution (Sakurada & Ikada,             1963). Interpenetrating polymer network (IPN) formed on PVA-CTS (Hoarea & Kohaneb, 2008). Squalen Vol. 7 No. 1, May 2012: 1-10. 5 determined by measuring the diameter of each clear zone  in  millimeter  at  around  of  gels  using  a  ruler provided. All of the operation procedures were done under aseptic condition. RESULT AND DISCUSSION When  irradiation  from  source  interacts  with  a polymer material, the polymer absorbs its energy and active species such as radicals are produced, thereby, initiating various chemical reaction. Crosslinking and degradation are two competing process that always co-exist under radiation (Mishra et al., 2007). In brief, there was a mechanism of crosslinking and degradation on this material when it is exposed to the irradiation. Let say, P is a symbol of PVA, and P*  is  a  radical  produced  as  a  result  of  hydrogen abstraction from the main-chain, and the radiolysis of PVA aqueous solution can be described in Fig. 2 and Fig. 3 (Sakurada & Ikada, 1963). The amount of P* produced by reaction (2) is very small compared to that  produced  by reaction  (3) and  (4).  The  rate of reaction of (7) is generally consider to be much higher than that of (5). Gel Fraction The variation of gel fraction of PVA-CTS hydrogels versus irradiation dose on hydrogels is presented in Fig. 4. It shows that the increase of the irradiation dose, the gel fraction of hydrogels gradually increased from 80% to 85% at the irradiation dose of 20 kGy and 30 kGy, respectively, and reached the maximum value of gel fraction of 90 % at the irradiation dose of 40 kGy. Then, the gel fraction decreases until 80% at the  irradiation  dose  of  50  kGy.  Thus,  there  is  a significant decrease in the gel fraction value as the irradiation dose increased in the range of this study. This result indicates that the PVA-CTS hydrogels with high  gel  fraction  of  90%  can  be  obtained  in  the presence of 2% chitosan at the irradiation dose of 40 kGy. Rekso & Sunarni (2009) used 10% PVA and CTS solutions with the ratio of PVA-CTS as 80% :  20% and irradiated the polymer at the dose of 20 kGy, 30 kGy, and 40kGy. He obtained the gel fraction of the polymer as 76.4%, 86.3%, and 87.4%, respectively. This gel fraction result is lower compared with our result  by  using  the  ratio  of  PVA-CTS  as  83.33% :17.67% and same irradiation dose, i.e. 83%, 87%, and 90%. Hydrogel of PVA-CTS blend has the higher gel fraction then PVA alone. Based on those data, the higher the CTS content in the hydrogel, the lower the gel fraction. Chitosan  is  a  natural  polysaccharide,  which  is degraded on  irradiation by breakdown of  the main chains (Hien et al., 2012). However, in this study PVA is the main component that is known as a polymer and crosslinked in aqueous medium (Zheng et al., 2008).  When  the  mixture  of  PVA-CTS  is  freezed- thawed and then it is irradiated, the interpenetrating polymer  network  (IPN)  is  formed  (Fig.  3)  with  the chemical crosslink of PVA and physical crosslink of CTS (Herman et al., 2009). Soerens et al. (2005, USA Patent 6967261) and Yang et.al (2008, USA Patent 20090297587) reported that the hydrogels with the gel fraction of ~80 % are suitable to be applied as wound dressings. It means that based on gel fraction, all  treatments  used  in  this  research  are  met  the requirement for wound dressing, and the best one is resulted from irradiation dose of 40 kGy. Water Absorption The water absorption of PVA-CTS hydrogel with variation of the irradiation dose is presented in Fig.5. It shows that the absorption of water increases along 6040200 100 80 60 40 20 0 Dose (kGy) G el f ra ct io n ( % ) Figure 4. Relationship of the irradiation dose (kGy) and the gel fraction (%) of PVA-CTS hydrogels. Synthesis of Polyvinyl Alcohol-Chitosan Hydrogel and Study .......... (T. Wikanta, Erizal, Tjahyono, and Sugiyono) 6 2826242220181614121086420 2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 Time (hrs) W at er a bs or pt io n (% ) 20 kGy 30 kGy 40 kGy 50 kGy Figure 5. Relationship of time (hours) and water absorption (%) of PVA-CTS hydrogel that was irradiated with               different dose. on the applications of hydrogel as a wound dressing it is needed to change wound dressing very often at about every 2-3 days. Based on those statements, the hydrogel prepared by irradiation dose of 50 kGy is the  most ideal  one,  and  that  of  by  40  kGy is  also ideally.  In contrast, Rekso & Sunarni using PVA-CTS ratio  as  80%  :  20%  reported  that  the  higher  the irradiation  dose,  the lower the water absorption  of hydrogel, i.e. at the irradiation dose of 20 kGy, 30 Gy, and  40  kGy,  got  the  water  absorption  as  166.1%, 104.6%,  and  90.9%,  respectiv ely.  This  water absorption result is lower compared with our result by using the ratio of PVA-CTS as 83.33% : 17.67% and same irradiation dose, i.e. 1700%, 1715%, and 1913 %, respectively. Rekso & Sunarni the found the water absorption of hydrogel with the irradiation dose of 20 kGy, 30 Gy, and 40 kGy were decreased, i.e. 92.2%, 57.8%, and 54.5% at 2 hours and 104%, 72.5%, and 70.3% at 4 hours dipping in aquadest, respectively. Whilst, we got much higher result and were increased on the water absorption of hydrogel with the irradiation dose  of  20  kGy,  30  Gy,  and  40  kGy,  i.e.  1.244%, 1.316%, and 1.475% at 2 hours and 1.332%, 1.384%, and  1.563%  at  4  hours  dippi ng  in  aquadest, respectively. The difference result probably because of mainly they used a PVA with lower molecular weight and also the chitosan with a lower molecular weight and degree of deacetylation, that it was not specified. Water Evaporation To examine the possibility of the hydrogel to be used as  wound dressing, we investigate the water evaporation rate from hydrogel at the temperature of 30°C with 40% humidity. Result is presented in Fig. Squalen Vol. 7 No. 1, May 2012: 1-10. ~ with the times howevers after 26 hours, it reached a limiting value which is an equilibrium condition. It was found  that  the  water  absorption  of  hydrogels  was increasing in accordance with the increasing of the irradiation  dose.  All  hydrogels  were  reached  the equilibrium  condition  in  25  hours,  i.e.  1.700%, 1.715%, 1.913%, and 2.036%, respectively, with the highest water absorption of ~ 2.000% at the irradiation of 40 kGy and 50 kGy. The  water  absorption  of  hydrogels  may  be supported by hydroxyl (OH) groups of PVA and amino (-NH 2 ) groups of CTS which is interacted with water molecules  through  hydrogen  bonding,  and  by  the presence  of  porous  network  in  the  hydrogel.  By increasing the irradiation dose, the crosslink density of PVA hydrogel increase, therefore the porosity of PVA hydrogel increase and the water diffusion into hydrogel increase. On the other hand, the increasing the irradiation dose the degradation of IPN CTS in the hydrogel increase, and the degradation product of its CTS was dissolved out of the hydrogel, and in turn due to the porosity of PVA hydrogel increase, the water absorption of hydrogel or water diffusion into hydrogel increase. The  PVA-CTS  hydrogel  prepared  by  gamma irradiation at the irradiation dose range of 40 kGy to 50  kGy  has  water  absorption  of  ~  2.000%,  it  is equivalent to swelling ratio of 20 g/g. Thus, it indicates that  this  hydrogel  absorb  all  the  effusive  wound exudates if it is used as wound dressing. Soeren et al. (2005) reported that the swelling ratio of hydrogel at value of 20 g/g is an ideal value to absorb an excess of wound exudates. According to Yang et al. (2008, USA Patent 20090297587) if the hydrogel has a water absorption value of 1/2 times lower of the ideal value, ~ 7 6. The water evaporation rate from hydrogel irradiated at the dose of 50 kGy at the initial 1 hour was very slow (~2%) and then increased very fast up to ~50 % at 24 hour. The water evaporation rate of hydrogel irradiated at the dose of 20 kGy, 30 kGy, 40 kGy, and 50  kGy  were  43%,  39.13%,  44%,  and  53%, respectively. The water evaporation rate of hydrogel irradiated by 20 kGy, 30 kGy, and 40 kGy are relatively 26242220181614121086420 60 50 40 30 20 10 0 Time (hrs) W at er e va p o ra ti o n ( % ) 20 kGy 30 kGy 40 kGy 50 kGy have same value, at about 40%, except irradiated by 50kGy is much higher. It is known that swelling capacity can prevent the accumulation  of  wound  exudates,  and  a  smaller evaporation rate can avoid very often changing the wound  dressing.  Therefore,  hydrogel  prepared  by irradiation dose of 20 kGy, 30 kGy, 40 kGy are suitable for wound dressing, and among of those, hydrogel irradiated by the dose of 30 kGy is the most suitable one. Whilst, hydrogel prepared by 50 kGy is the worse. Yang et al. (2008) reported that irradiation dose of 30 kGy is suitable irradiation dose for preparation of PVA- CTS hydrogel. They obtained that water evaporation rate of the PVA-CTS hydrogel was very fast (~100 %) for 6 hour standing at room temperature. Elongation at Break Elongation at break is an important physical factor of hydrogel representing its flexibility when it is used for wound dressings. The aims of measurement on the elongation at break of hydrogel in this experiment was  to get  a  supporting  data for  hydrogel  product specification. Until now, there is no available reference related with the standard values of elongation at break for wound dressing. Generally, the more flexible of hydrogel the easier to follow the skin surface contour (Soerens  &  Malik,  2005;  Yang  et al.,  2008).  The relationship  of  elongation  at  break  of  PVA-CTS hydrogel with the irradiation dose is presented in Fig 7.  The  initial  elongation  at  break  of  hydrogel  with irradiation dose of 20 kGy is 245%. The elongation at break  of  hydrogel  increased  with  increasing  the irradiation dose from 20 kGy to 30 kGy, become 322%, and  kept  constant  at  40  kGy  (322%),  and  then decreased at 50 kGy, become 205%. It indicates that irradiation dose at range of 30-40 kGy is the optimum dose to get maximum value of the elongation at break of PVA-CTS hydrogel. Decreasing of elongation at break of hydrogel at the irradiation dose more than of 40 kGy may be due to  degradation  of  chitosan  in  the  hydrogel  matrix, distributed unhomogeneously and uncrosslinked with resulting a harder and less extensible hydrogel. In Vitro Antibacterial Assay In the biomedical field, the product used must be free of bacteria or has an antibacterial activity. Hydrogel prepared for wound dressing or biomedical application has to be sterilized or free of any microorganisms. Here, the PVA hydrogel with and without chitosan have been made by irradiation and were tested against many bacteria to confirm whether chitosan addition on PVA can  improve  the  antibacterial  activity  of  the  PVA hydrogel  or  the  product  meet  the  requirement  for biomedical  application.  The  clear  zones  diameter formed as representing the inhibition activity of PVA- CTS hydrogel tested against 7 bacteria is presented in Table 1. The results showed that all the hydrogel containing chitosan (treatment) inhibited the growth of all the bacteria tested with bigger inhibition zone (7-8  mm)  than  PVA  hydrogel  without  chitosan  or neg ati v e   con trol   (6-7  m m ).  Com p ari ng   to Figure 6. Relationship of time and water evaporation rate of PVA-CTS hydrogel that was irradiated with different   dose. Synthesis of Polyvinyl Alcohol-Chitosan Hydrogel and Study .......... (T. Wikanta, Erizal, Tjahyono, and Sugiyono) 8 6040200 400 300 200 100 0 Dose (kGy) E lo n g a ti o n a t b re a k ( % ) Figure  7. Relationship of irradiation dose (kGy) and elongation at break of PVA-CTS hydrogel. Ba cte ria 1 2 3 4 5 6 7 8 9 E c . 6 6 6 7 7 8 8 7 8 S a 6 6 6 7 7 7 8 7 8 B s t 6 6 6 7 7 7 8 7 8 S ty 6 6 6 7 7 8 8 7 8 S h 6 6 6 7 7 8 8 7 8 P a 6 6 6 7 7 8 8 7 8 B s 6 6 6 7 8 8 8 7 8 Inhibition Zone Dia m e te r (m m ) of Hydroge l Table 1. Antimicrobial activities of irradiated PVA-CTS hydrogel Notes: Negative control were 1). PVA ( 20 kGy); 2). PVA (30 kGy); 3). (40 kGy); 4). PVA (50kGy); Treatments were  5). PVA-CTS  (20 kGy);  6). PVA-CTS (30 kGy);  7). PVA-CTS  (40 kGy);   8). PVA-CTS (50 kGy); Positive control was 9). Chloroamphenicol; Disc diameter was 5 mm; Bacteria tester : Ec = E. coli; Sa = Staphylococcus aureus; Bst = Bacillus stearothermophilus, Sty = Salmonella typhimurium; Sh = Streptococcus sp.; Pa = Pseudomonas aeroginosa; Bs = Bacillus subtilis; chloramphenicol  as a positive  control (8  mm),  the antibacterial activity of PVA-CTS hydrogel (30 kGy and  40  kGy)  hav e  same  potency  (8  mm)  with chloramphenicol.  The  antibacterial  properties  of hydrogel containing chitosan is due to a positive charge of  the amino-group  in chitosan  that and  it has  the ability to bind to a negative charge in bacteria (Tsai & Su, 1999). CONCLUSION A series of PVA hydrogel containing chitosan were synthesized by combination of freeze-thawing and irradiation  technique  and  their  properties  were compared with PVA hydrogel without chitosan. Results showed that PVA-CTS hydrogels have high gel fraction (83-90%),  high  water  absorption  capacity  (1.201- 1.441% in 1  hour; 1.700-2.036%  in 25 hours),  low water evaporation rate (43-53%), high elongation at break (205-322%),  good  antibacterial  activity,  and translucent appearance. Increasing the irradiation dose of 20 kGy until 50 kGy, will result in increased the gel fraction, increased the water absorption, relatively low and constant of water evaporation rate except at the dose of 50 kGy, increased elongation at break except at the dose of 50 kGy, and increased the antibacterial activity except at the dose of 50 kGy. Squalen Vol. 7 No. 1, May 2012: 1-10. 9 All the PVA-CTS hydrogels showed an antibacterial activity  against  E. coli, Staphylococcus aureus, Bacillus stearothermophilus, Salmonella typhimurium, Streptococcus sp., Pseudomonas aeroginosa, and Bacillus subtilis. Based on all parameters measured, PVA-Chitosan hydrogels produced by irradiation dose of 40 kGy is the best one. In fact, the product of 30 kGy and 40 kGy has similar properties, hence from economical view point (time of irradiation, dose rate was  10  kGy/hour),  the  product  of  30  kGy  is  more promising. ACKNOWLEDGMENT The  authors  were  grateful  to  colleagues  at irradiation facilities PATIR-BATAN which  has been providing  the  samples  irradiation  and  to  Prof.  Ir. Sugiarto  Danu  for  his  v aluable  comments  and discussions, and to Miss Umi Rahayu at Research and Development Center for Marine and Fisheries Product Processing and Biotechnology for her valuable help on the antibacterial assay. REFERENCES A n on ym ou s.  20 0 6 .  H an db o o k   o f  P harm ac eu tic al Excipients. In:  Rowe, R.C., Sheskey, P.J.,  and Owen, S .C.  (Ed s),  5 th  eds.  A m eric an  P h armac eu tic al Association,  Pharmaceutical  Press,  W ashington, USA. p. 234–239. B ajpai,  A .K .  an d   S ain i,  R .  2 00 5 .  Preparatio n   an d characterization  of  biocompatible  spongy  cryogels of  poly  (vinyl  alcohol)-gelatin  and  study  of  water sorption  behavior.  Polymer International.  54  (9): 1124–1233. Barndl, F.,  Kastner,  F., Ruth, M.G.,  Blunk, T., Tebmar, J., Gopferich,  A.  2010.  Hydrogel-based  drug  delivery systems:  Comparison  of  drug  diffusivity  and  release kinetics.  J. Control Release.  142,  221–228. Cheng, L., Muller, S.J., and Radke, C.J. 2004. Wettability of  silicone-hydrogel  contact  lenses  in  the  presence of tear-film components. Curr. Eye Res. 28: 93–108. Dillehay,  S.M.  and  Miller,  M.B.  2007.  Performance  of Lotrafilcon  B  silicone  hydrogel  contact  lenses  in experienced  low-Dk/t daily lens wearers. Eye Contact Lens. 33:  272–277. Erizal and Chosdu, R. 2009. Thermoresponsive Hydrogel of Poly vinyl Alcohol (PVA)-co-N-isopropyl Acrylamide (N IPAA M)  P repared  by  γ-Radiatio n  As  A  M atrix Pump ing/On-O ff  System.  Indon esian J ournal of Chemistry.  9 (1):  19–27. Erizal  and  Abidin,  Z.  2011.  Sintesis  hidrogel  campuran poli(vinil  alco hol)  (PVA )-Natrium   Alg inat  den gan ko mbinasi  beku-leleh  d an  radiasi  gamma  untuk bahan  pembalut  luka.  A Scientific Journal for the Applications of Isotopes and radiation. 7 (1): 21–28. E rizal,  A b id in,  Z .,  D eswita,  an d   Su d irm an .  2 011 . Superabsorben  Poli(akrilamida-ko-Asam  Akrilat)- K ito san  H asil  Irad iasi  G amm a  U ntu k   ad so rp si IonLogam  Cu2+  dan  Fe  3+,  Jurnal Sains Materi Indonesia. 12  (3):  168–174. Goosen, M.F.A.1997. Application of Chitin and Chitosan. Technomic  Publishing  Co.  Inc,  Pennsylvania,  USA. 336  pp. Herman,  S.M.,  Ezequiel,  de  S.,  Costa,  Alexandra,  A.P., Mansur,  Figueiredo ,  E.,  and  Stanc ioli,  B.  200 9. Cytocompatibility  evaluation  in  cell-culture  systems of  chemically  crosslinked  chitosan/PVA  hydrogels. Materials Science and Engineering.  C  29(5):  1574– 1583. Hien  N.Q.,  Phu,  D.V.,  Duy,  N.N.,  and  Lan,  N.T.K.  2012. D eg rad atio n  o f  c hitosan   in   so lu tio n   b y  g amm a irradiation  in  the  presence  of  hydrogen  peroxide. Carbohydrate Polymers.  87  (1):  935–938. Hoarea, T.R. and Kohaneb, D.S., 2008. Hydrogels in drug delivery:  Progress  and  challenges.  Polymer.  4 9: 1993–2007. Liu,  X.F.,  Guan, Y.L.,  Yang,  D.Z.,  Zhi,  Li.,  and  Yao,  K.D. 2 0 01 .  A ntib acterial  A c tio n   o f  C h ito san   an d Carboxymethylated Chitosan. J. Applied Polymer Sci. 79:  1324–1335. Lopergolo,  L.C.,  Lugao,  A.B.,  and  Catalaini,  L.H.  2002. D evelo p men t  of  a  po ly  (N -vinyl-2 -p yrrolid o ne)/ poly(ethylene  glycol)  hydrogel  membrane  reinforced with  methyl methacrylate-grafted  polypropylene  fibers for  possible  use  as  wound  dressing.  J. of Appl. Polym. Sci.  86 (3):  662–666. Tombs, M.P.  and Harding,  S.E. 1998. An Introduction to Polysaccharide Biotechnology.  Taylor  and  Francis, UK. p. 147–149. Mishra, S.,  Bajpai, R., Katare,  R., and Bajpai, A.K. 2007. R ad iation   in du c ed   cro sslin kin g  effect  o n   semi- interp en etrating   p o lymer  n etw orks  of  po ly(vinyl alcohol). eXPRESS Polymer Letters. 1 (7): 407–415. Nho, Y.C. and Park, K.R. 2002. Preparation and properties o f  P VA /P V P  hyd ro gels  c o n tain in g  c h ito san  b y radiation. J. of Appl. Polym. Sci. 85 (8):  1787–1794. N u gen t,  M .J .D.,  H an ley,  A .,  To m k in s,  P.T.,  an d Higginbotham,  C.L.  2005.  Investigation  of  a  novel freeze-thaw   process  for  th e  p rod uction   of  drug delivery  hydrogels.  Journal of Materials Science- Materials in Medicine. 16  (12): 1149–1158. Pai, K.,  Banthia, A.K., and Mayumdar, D.K. 2006.  Starch based  hydrogel with potential as artificial skin. J. Biol. Res. 9: 23–29. Panos,  I.,  Acosta,  N.,  and  Heras,  A.  2008.  New  drug delivery  systems  based  on  chitosan.  Current Drug Discovery Technologies  5:  333–341. Park, J.E. and Barbul, A. 2004. Understanding the role of immune  regulation  in  wound  healing.  Am. J. Surg. 187:  511–516. Rekso,  G.T. and  Sunarni, A.,  2009. The characteristic  of polyvinyl  alcohol–chitosan  hydrogel  produced  by g amm a  ray  irrad iatio n.  In d on e s ia n J o u rn al o f Materials Science. 10 (3): 213–217.  Risbud,  M., Hardikar, A., and  Bhonde, R.  2000. Growth m o du latio n   o f  fib ro b last  b y  c h itosan -po lyvin yl p yrro lid o n e  h yd rog el:  Im p lic atio n   fo r  w ou n d management. J. Bio.Sci.  25  (1):  25–31. Synthesis of Polyvinyl Alcohol-Chitosan Hydrogel and Study .......... (T. Wikanta, Erizal, Tjahyono, and Sugiyono) 10 Rollins,  D.M.  and  Joseph,  S.W.  2000.  Antibiotic  Disk Susceptibilities  (Kirby-Bauer  Disk-Diffusion  Method). BSCI  424  Antibiotic  Disk  Suceptibilities.  Retrieved from  http:life.umd.educlasroom/bsci424. Accessed on 20 Juni 2012. Sakurada,  I.  and  Ikada,  Y.  1963.  Effects  of  Gamma Radiatio n  on  polymer  in  solution.  (VI)  R adiation Protection    and  Promotion  in  Aqueous  Solution  of Polyvinyl Alcohol).  Sakurada Laboratory, Institute for Chemical Research and Department of Polymer Chemistry, Kyoto University. Seng, S.N., Su, K., Li, C., Mary, B., Park, C., Wang, D.A., and Chan, V. 2012. Biomechanical study of the edge o u tg ro w th   p h en o m eno n   o f  en c ap su lated chondrocytic  isogenous  groups  in  the  surface  layer of  hydrogel  scaffolds  for  cartilage  tissue  engineering. Acta Biomaterialia.  8:  244–252. Soerens, D.A. and Malik,S. 2005. Patent 6967261 (USA) Stasko, J., Kalnins, M., Dzene, A., and Tupureina, V. 2009. Poly(vinyl  alcohol)  hydrogels.  Proceeding of the Estonian Academy of Sciences. 58  (1): 63–66. Thomas, R. 2007. Wound  Healing. Retrieved from Http:/ /emedicene.com/ent/TOPIC13 HTM. Accesed on April 2012. Tsai, G.J. and Su, W.H. 199. Antibacterial activity of shrimp chitosan  against  Escherichia  coli.  Journal of Food Protection  62  (3):  239–243. Wang, T., Zhu, X.K., Xue, X.T., and Wu,D.Y. 2012. Hydrogel sheets of chitosan, honey and gelatin as burn wound dressings.  Carbohydrate Polymers.  88:  75–83. Yang, Z., Rao, Z., Ling, Y.S., and Zhu, Y.N. 2008. Patent 20090297587  (USA). Zhao,  L.,  Mitomo,  H.,  Zhai,  M.L.,  Yoshii,  F.,  Nagasawa, N.,  and  Kume,  T.  2003.    Synthesis  of  antibacterial PVA/CM-chitosan blend hydrogels with electron beam irradiation. Carbohydrate Polymers 53 (4):  439–446. Zheng, Y., Huang, X., Wang, Y., Xi, T., Chen, X., and Xu, H. 2008. The  surface  lubricative  properties  of  PVA/PVP hydrogels  treated  with  radiation  used  as  artificial cartilage.  Applied Surface Science.  p.  568–570. Squalen Vol. 7 No. 1, May 2012: 1-10.