Upsala J M e d Sci 92: 89-98, 1987 Validity of Hill's Equation in an Artificial Actomyosin Streaming System Erik C e r v e n The Faculty of Pharmaceutical Sciences, University of Tokyo, Bunkyo-ku, Tokyo 113, Japan A B S T R A C T T h e r o t a t i o n o f a n a c t o m y o s i n m o t o r ( 9 , 1 1 ) , a s s e m b l e d f r o m b l a - d e s , o n e s i d e o n t o w h i c h F - a c t i n o f u n i f o r m p o l a r i t y w a s a t t a c h e d , s u s p e n d e d i n a s o l u t i o n o f h e a v y m e r o m y o s i n (HMM), w a s m o d e l l e d a s d u e t o s l i d i n g o f H M M o v e r t h e m a r g i n s o f t h e b l a d e s , w h e r e b y t h e w o r k r e s u l t i n g f r o m A T P a s e a c t i v i t y i s u s e d f o r p u s h i n g b u l k f l u i d c o n t a i n i n g H M M f r o m t h e l e a d i n g s u r f a c e o f t h e b l a d e o v e r t h e f o r - c e - g e n e r a t i n g f i l a m e n t s t o t h e b a c k s u r f a c e , w h i c h l e a d s t o i n c r e - a s e d s l i d i n g v e l o c i t y . T h e a m o u n t o f H M M c o n t r i b u t i n g t o f o r c e - g e - n e r a t i o n i s d i v i d e d i n t o o n e c o m p o n e n t p e r p e n d i c u l a r t o t h e f i l a - m e n t s , w h i c h i s d i f f u s i o n - l i m i t e d a n d r e g u l a t e d b y a c o m p o n e n t p a - r a l l e l t o t h e f i l a m e n t s , r e p r e s e n t e d b y t h e m o v e m e n t o f t h e b u l k f l u i d , t h e s u p p l y o f n e w H M M a n d t h e o b s e r v a b l e v e l o c i t y o f r o t a - t i o n o f t h e b l a d e . U s i n g H i l l ' s e q u a t i o n ( 6 ) w h i c h e s s e n t i a l l y s t a - t e s t h a t t h e p r o d u c t o f a v i r t u a l f o r c e a n d a v i r t u a l v e l o c i t y i s c o n s t a n t w i t h i n t h e r a n g e of o b s e r v a b l e f o r c e s a n d v e l o c i t i e s , t h e f o r c e c a n b e e x p r e s s e d a s v e l o c i t y , g i v i n g a s i m p l e f i r s t o r d e r d i f f e r e n t i a l e q u a t i o n . A s o l u t i o n t o t h i s e q u a t i o n c a n b e f i t t e d t o t h e o b s e r v e d d a t a w i t h p h y s i c a l l y m e a n i n g f u l c o n s t a n t s i n terms o f m a s s , v i s c o s i t y , t h e f o r c e - v e l o c i t y c o n s t a n t a n d a c o n s t a n t e x - p r e s s i n g t h e q u a l i t y o f t h e p r e p a r a t i o n . C o n t r o l e x p e r i m e n t s were p e r f o r m e d , u s i n g f i x e d b l a d e s . I n t h e s e e x p e r i m e n t s , b u l k f l o w a r o u n d t h e m a r g i n s d i d n o t i n c r e a s e a s a r e s u l t o f A T P a s e a c t i v i t y a n d n o m o v e m e n t o r s t r e a m i n g w a s o b s e r v e d . T h e r e s u l t s s h o w t h a t H i l l ' s e q u a t i o n may b e a p p l i c a b l e t o s t r e a m i n g c a u s e d b y a c t o m y o - s i n i r r e s p e c t i v e o f i t s c o n f i n e m e n t t o s k e l e t a l m u s c l e a n d i n d e p e n - d e n t l y o f p r e f e r r e d m o l e c u l a r m o d e l , a n d l e a d s t o s e v e r a l v e r i f y - a b l e p r e d i c t i o n s . 89 I N T R O D U C T I O N H i l l ' s e q u a t i o n i s a n e m p i r i c a l e q u a t i o n w h i c h d e s c r i b e s t h e f o r c e - v e l o c i t y r e l a t i o n s h i p o f c o n t r a c t i n g s k e l e t a l m u s c l e ( 6 ) . I t c a n b e d e r i v e d f r o m c o n s i d e r a t i o n s o f t h e m o l e c u l a r m e c h a n i s m o f a c t o m y o s i n i n t e r a c t i o n , p r o v i d i n g a m a t h e m a t i c a l f o u n d a t i o n f o r t h e s l i d i n g - f i l a m e n t m o d e l o f m u s c u l a r c o n t r a c t i o n ( 7 ) . T h i s s h o w s t h a t t h e m a c r o s c o p i c b e h a v i o u r o f w h o l e m u s c l e may f o l l o w f r o m p o s - t u l a t e d m o l e c u l a r e v e n t s ( 7 , 8 ) a n d r a i s e s t h e q u e s t i o n how c l o s e t o t h e e x p e r i m e n t a l m o l e c u l a r l e v e l H i l l ' s e q u a t i o n may a c t u a l l y b e v a l i d . I n t h e p r e s e n t r e p o r t , it i s s h o w n t h a t t h e m o v e m e n t o f a n a r t i f i c i a l a c t o m y o s i n s t r e a m i n g s y s t e m , t h e " a c t o m y o s i n m o t o r " ( Y , l l ) , i s c o m p a t i b l e w i t h H i l l ' s e q u a t i o n . T h i s t a k e s H i l l ' s e q u - a t i o n f r o m w h o l e m u s c l e , b y p a s s i n g t h e c e l l u l a r a n d s a r c o m e r i c l e - v e l s , d o w n t o t h e s u p r a m o l e c u l a r l e v e l a s r e p r e s e n t e d b y t h e j o i n t a c t i n s t r a n d s o n t h e b l a d e s o f t h e a c t o m y o s i n m o t o r . T h e r e f o r e , t h e p r e s e n t a n a l y s i s j u s t i f i e s m o d e l s w h e r e t h e a c t o m y o s i n i n t e r - a c t i o n i n s u p r a m o l e c u l a r s t r u c t u r e s i t s e l f , r e g a r d l e s s of e l a s t i - c i t y o r o t h e r m a c r o s c o p i c p a r a m e t e r s o f w h o l e s k e l e t a l m u s c l e o r s a r c o m e r e s , p r o v i d e s t h e b a s i s of H i l l ' s e q u a t i o n . METHODS T h e m e t h o d s h a v e b e e n d e s c r i b e d b e f o r e ( 9 , 1 1 1 . B r i e f l y , a c t i n w a s p r e p a r e d f r o m c o n t r a c t e d a c e t o n e d r y p o w d e r ( 3 , l O ) a n d h e a v y m e r o m y o s i n b y t r y p t i c d i g e s t i o n o f m y o s i n f o r 5 m i n a t 2 0 C a t a w e i g h t r a t i o ( t r y p s i n l m y o s i n ) of 1 1 2 0 0 . T h e m y o s i n h a d b e e n e x t - r a c t e d f r o m m i n c e d m u s c l e i n 0.2 M p h o s p h a t e b u f f e r , pH 6 . 4 - 6 . 5 , c o n t a i n i n g 0.5 M p o t a s s i u m c h l o r i d e a n d i n a d d i t i o n p h o s p h o c r e a - t i n e t o a v o i d a c c u m u l a t i o n o f ADP a s p r e v i o u s l y c a u t i o n e d ( 5 ) . T h e a c t i n was p o l y m e r i z e d o n t o p o l y l y s i n e - c o a t e d t e f l o n a t t a c h e d t o mica o n a n " a c t o m y o s i n m o t o r " a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 9 , l l ) . T h e a c t o m y o s i n m o t o r h a s s i x b l a d e s w i t h a l l t o g e t h e r 2 4 m a r g i n s . I n a c o n t r o l e x p e r i m e n t , 2 4 b l a d e s were a t t a c h e d t o t h e i n n e r s u r - f a c e o f a c y l i n d r i c a l c o n t a i n e r , w i t h f r e e m a r g i n s f a c i n g a 2 m m s l i t a n d t h e b o t t o m o f t h e c o n t a i n e r . T h e a c t o m y o s i n m o t o r a n d t h e c o n t r o l d e v i s e a r e s c h e m a t i c a l l y i l l u s t r a t e d i n F i g . 1 A a n d B , r e s p e c t i v e l y . A f t e r p o l y m e r i z a t i o n , n a t i v e t r o p o m y o s i n ( 4 ) , c o n t a - i n i n g b o t h t r o p o n i n a n d t r o p o m y o s i n was e q u i l i b r a t e d w i t h t h e a c - t i n , t h e b l a d e s w a s h e d b r i e f l y i n b u f f e r e d K C 1 a n d s t o r e d i n t h e c o l d room o v e r n i g h t . B e f o r e t h e e x p e r i m e n t , t h e d e v i s e was t r a n s - 0 f e r r e d t o a s o l u t i o n c o n t a i n i n g 1 g / 1 'of H M M i n 9 0 m M K C 1 , 4 m M MgC1, 1 0 m M M o p s , p H 7.0 f o l l o w e d b y t ' h e a d d i t i o n o f A T P t o 2 m M a n d Ca i o n s t o 3 0 uM. T h e m o v e m e n t w a s o b s e r v e d u s i n g a l o w - m a g - n i f y i n g m i c r o s c o p e a n d v i d e o e q u i p m e n t a n d s u b s e q u e n t l y q u a n t i f i e d b y m a n u a l l y m e a s u r i n g t h e a n g l e o f m o v e m e n t on t h e TV s c r e e n . F i g . 1. A . I l l u s t r a t i o n o f t h e f l o w o f H M M - c o n t a i n i n g b u f f e r a r o - u n d t h e m a r g i n s o f t h e " a c t o m y o s i n m o t o r " a s i t r o t a t e s i n t h e s o - l u t i o n w h e r e i t i s s u s p e n d e d b y a f l o a t i n g c o r k T h e a c t o m y o s i n mo- t o r c o n s i s t s o f s i x b l a d e s , o n e s i d e o n t o w h i c h a c t i n o f u n i f o r m p o l a r i t y h a s b e e n a t t a c h e d , t h e a r r o w h e a d d i r e c t i o n p o i n t i n g t o - w a r d s t h e b l a d e . A s a r e s u l t o f f o r c e - g e n e r a t i o n d u e t o t h e i n t e r - a c t i o n o f H M M w i t h a c t i n , t h e b l a d e s a r e p u s h e d f o r w a r d a n d s o l u - t i o n s t a r t s t o f l o w a r o u n d t h e m a r g i n s ( i n d i c a t e d b y b l a c k a r r o w s f B. I l l u s t r a t i o n o f t h e f l o w o f s o l u t i o n a t t h e m a r g i n s o f t h e c o n - t r o l d e v i s e i n w h i c h t h e b l a d e s a r e f i x e d . I n t h i s c a s e , t h e f o r c e c a n n o t b e u t i l i z e d f o r p u s h i n g m o r e H M M f r o m t h e a n t e r i o r s i d e o f t h e b l a d e s o n t o t h e m a r g i n a l f i l a m e n t s . R E S U L T S A N D DISCUSSION T h e m o v e m e n t o f f l u i d a r o u n d t h e m a r g i n s o f t h e s i x s u s p e n d e d b l a d e s o f t h e a c t o m y o s i n m o t o r a n d t h e c o n t r o l d e v i s e a r e i l l u s t - r a t e d i n F i g . 1 A a n d B , r e s p e c t i v e l y . I n t h e a c t o m y o s i n m o t o r , t h e f o r c e g e n e r a t e d i s p r e s u m e d t o b e p r o p o r t i o n a l t o t h e a m o u n t o f H M M w h i c h c a n d i f f u s e o n t o t h e a c t i n f i l a m e n t s a t t h e i n i t i a l v e l o c i t y t i m e s t h e a m o u n t o f H M M n e w l y s u p p l i e d b y t h e b u l k f l o w a r o u n d t h e m a r g i n s , w h i c h i s p r o p o r t i o n a l t o t h e o b s e r v e d v e l o c i t y 91 o f r o t a t i o n , v . I n t h e c o n t r o l d e v i s e , t h e b l a d e s a r e f i x e d t o t h e w a l l o f t h e c y l i n d e r a n d , a s a c o n s e q u e n c e , n o b u l k f l u i d c a n b e p u s h e d a r o u n d t h e m a r g i n s a n d t h e s t r e a m i n g w i l l r e m a i n a t t h e i n i - t i a l d i f f u s i o n - l i m i t e d v e l o c i t y . T h e a v e r a g e i n t e r m o l e c u l a r d i s t a n c e i n a s o l u t i o n c o n t a i n i n g 1 g / 1 o f H M M ( w h i c h i s s u f f i c i e n t t o o b s e r v e m o v e m e n t ) i s a p p r o x i - m a t e l y 1 0 0 0 A , a n d t h e d i a m e t e r o f t h e a c t i v e g l o b u l a r p o r t i o n of o n e s u b - u n i t o f H M M i s i n t h e r a n g e o f 1 0 0 A , a p p r o x i m a t e l y 1 0 t i - mes l e s s . If i t i s a s s u m e d t h a t t h e H M M w h i c h i n t e r a c t s w i t h a c t i n i s t r a n s - l o c a t e d u n d e r n o l o a d a l o n g t h e f i l a m e n t w i t h a v e l o c i t y o f a t l e a s t 1 2 u m / s ( F i g . 2 ) i t w o u l d h a v e t o b e r e p l a c e d w i t h i n l e s s t h a n 0 . 8 m s w h i c h i s t h e t i m e i t t a k e s f o r i t t o l e a v e a n e l e - m e n t a r y s p a c e o f 1 0 0 A o n t h e f i l a m e n t . S i n c e t h e i n t e r - m o l e c u l a r d i s t a n c e i n s o l u t i o n i s , o n a v e r a g e , 1 0 t i m e s l o n g e r t h a n t h a t , a n d t h e o r i e n t a t i o n o f H M M i s r a n d o m , t h e p r o b a b i l i t y o f s u c h i n s - t a n t a n e o u s r e p l a c e m e n t f r o m t h e s o l u t i o n o f H M M m o l e c u l e s m o v i n g o n t h e f i l a m e n t s i s e v i d e n t l y l o w . T h e c o n t r i b u t i o n t o t h e p r o b a - b i l i t y g i v e n b y e a c h m o l e c u l e i s p r o v i d e d b y e q u a t i o n ( 1 1 , w h i c h d e s c r i b e s t h e t h r e e - d i m e n s i o n a l d i f f u s i o n c a s e : I n t h i s e q u a t i o n , d x i s o f t h e o r d e r o f m a g n i t u d e o f t h e m o l e c u l a r d i m e n s i o n s o f t h e H M M m o l e c u l e w h i c h i s t o b e r e p l a c e d , D t h e d i f - f u s i o n c o e f f i c i e n t o f H M M a n d x a m u l t i p l e o f t h e a v e r a g e i n t e r - - m o l e c u l a r d i s t a n c e b e t w e e n H M M m o l e c u l e s i n t h e s o l u t i o n . T h e r e - l e v a n t t i m e i s s h o r t e r t h a n 1 m s w h i c h c o r r e s p o n d s t o t h e d i s t a n c e o f " e l e m e n t a r y " d i s p l a c e m e n t o f a n H M M m o l e c u l e w i t h t w o h e a d s a s - s u m i n g t h a t i t s m a x i m a l v e l o c i t y i s h i g h e r t h a n 1 2 u m / s , w h i c h i s t h e o b s e r v e d v e l o c i t y o f r o t a t i o n i n t h e e x p e r i m e n t a n a l y s e d ( F i g . 2 ) . E q u a t i o n ( 1 ) d o e s n o t a l l o w f o r s t e r i c f a c t o r s i n t h a t o n l y c e r t a i n o r i e n t a t i o n s o f o n - d i f f u s i n g H M M c a n c o n t r i b u t e t o f o r c e g e n e r a t i o n . F r o m t h e c o n s i d e r a t i o n s a b o v e , i t seems r e a s o n a b l e t o a s s u m e t h a t t h e b u l k f l o w a r o u n d t h e m a r g i n s s u p p l i e s H M M t o s u s t a i n move- m e n t , a n d t h a t a s more H M M i s a d d e d w h e n t h e v e l o c i t y of s t r e a m i n g i n c r e a s e s , t h e f o r c e d e v e l o p m e n t w o u l d a l s o i n c r e a s e a s a f u n c t i o n o f t h e a m o u n t o f H M M s u p p l i e d . T h i s s i t u a t i o n r e s e m b l e s t h a t w h e n t h e d e g r e e of o v e r l a p i n t h e s a r c o m e r e of s k e l e t a l m u s c l e d e t e r - 92 m i n e s how m u c h m y o s i n i s s u p p l i e d t o t h e f o r c e - g e n e r a t i n g s y s - tem a n d i s i n d e p e n d e n t o n w h e t h e r t h e H M M i s s u p p l i e d i n d i v i d u a l l y o r i n t h e f o r m o f s m a l l a g g r e g a t e s . T h e p r e s e n c e o f a g g r e g a t e s o f H M M i n t h e p r e s e n t s y s t e m w o u l d s t r o n g l y f a v o u r t h e a r g u m e n t s p r e - s e n t e d b e c a u s e of t h e l o n g e r i n t e r - m o l e c u l a r d i s t a n c e b e t w e e n t h e o l i g o m e r s a n d t h e i r s l o w e r d i f f u s i o n . F i n a l l y , t h e i d e a t h a t t h e f l o w a r o u n d t h e m a r g i n s s u p p l i e s H M M t o t h e p r e s e n t f o r c e - g e n e r a - t i n g s y s t e m i s c o m p a t i b l e w i t h t h e r e c e n t o b s e r v a t i o n o f a c o m p a - r a t i v e l y s l o w v e l o c i t y o f s t r e a m i n g ( 1 u m / s ) i n a s y s t e m w i t h e i t - h e r o n e o r s e v e r a l h u n d r e d c l o s e l y a p p o s e d b u t i m m o b i l e m a r g i n s o f p o l a r i z e d a c t i n ( 1 2 ) r e l a t i v e t o t h e m a x i m a l v e l o c i t y o f m o v e - m e n t o b s e r v e d i n t h e p r e s e n t s y s t e m , w h i c h i s 40 u m / s ( 1 1 ) . A s s u m i n g l a m i n a r f l o w , t h e s u p p l y o f H M M t o t h e f o r c e - g e n e r a - t i n g s i t e i s a l i n e a r f u n c t i o n o f v e l o c i t y , w h i c h i s d e s c r i b e d b y : = K v v F u F t o t T h i s e q u a t i o n e x p r e s s e s t h a t t h e t o t a l f o r c e d e v e l o p m e n t , F t o t , i s r e g a r d e d a s p r o p o r t i o n a l t o a p r o d u c t o f t w o c o m p o n e n t s , o n e o f w h i c h i s t h e e x t r a s u p p l y of H M M i n t h e l a m i n a r f l o w , t h e " o v e r - l a p " , r e p r e s e n t e d b y v , w h i c h i s t h e o b s e r v e d v e l o c i t y o f s t r e a - m i n g , a n d t h e o t h e r o f w h i c h i s t h e s p e c i f i c f o r c e d e v e l o p m e n t o f H M M , r e l a t e d t o a u n i t a r y a m o u n t o f t h a t p r o t e i n a n d d e n o t e d b y s t a n d s f o r " u n i t a r y " . K i s a c o n s t a n t w h i c h r e - F u . T h e i n d e x " u " l a t e s t h e v e l o c i t y o f s t r e a m i n g t o t h e a d d i t i o n a l f o r c e p r o v i d e d b y some o f t h e H M M m o l e c u l e s s u p p l i e d i n t h e f l o w w h e n t h e y i n t e r - a c t w i t h t h e a c t i n s t r a n d s . T h e u n i t a r y f o r c e , F u , w h i c h c a n n o t b e r e l a t e d t o a n y m o l e c u l a r m e c h a n i s m i n t h e p r e s e n t t r e a t m e n t wo- u l d b e r e l e v a n t t o i t a n d t o t h e o b s e r v e d m o v e m e n t a n d a c c e l e r a - t i o n o f t h e a c t o m y o s i n m o t o r . T h e f o r c e p r o d u c e d b y t h e e l e m e n t a r y c y c l e s o f H M M l e ' s d s t o a c c e l e r a t i o n o f t h e d e v i s e u n t i l i t s r o t a - t i o n a l v e l o c i t y i s b a l a n c e d b y t h e f l o w f r i c t i o n . T h i s c a n b e d e s - c r i b e d b y : V - c v e F t o t m a = K ( 3 ) w h e r e m i s t h e m a s s o f t h e a c t o m y o s i n m o t o r , K e a n e x p e r i m e n t a l c o n s t a n t r e l a t i n g t o t h e l e n g t h o f t h e m a r g i n s , t h e q u a l i t y o f t h e p r o t e i n s a n d o f t h e p r e p a r a t i o n a n d p r e s u m a b l y t h e l e n g t h o f t h e a c t i n f i l a m e n t s a n d t h e i r c o h e r e n c e ( c f . 2 ) . c i s t h e f r i c - 93 t j o n a l c o n s t a n t . I f ( 2 ) i s i n s e r t e d i n t o ( 3 ) , we g e t : m a = K v F - c v ( 4 ) U w h e r e F i s t h e u n i t a r y f o r c e . K v a n d K a r e i n c o r p o r a t e d i n t o t h i s n e w c o n s t a n t K. T h i s e x p r e s s i o n p r o v i d e s t h e o b s e r v e d a c c e - l e r a t i o n d v / d t , w h i c h i s g j v e n b y : U d v K F u v - CV_ - - d t m m ( 5 H i l l ' s e q u a t i o n , u s u a l l y g i v e n i n t h e f o r m ( P + a ) * ( v i - b ) = c , w h e r e P i s t h e t e n s i o n o f c o n t r a c t i n g m u s c l e , v t h e v e l o c i t y o f c o n t r a c t i o n , a n d a a n d b c o n s t a n t s o f d i m e n s i o n f o r c e a n d v e l o c i - t y , r e s p e c t i v e l y ( c i s t h e f o r c e - v e l o c i t y c o n s t a n t ) , e s s e n t i a l l y s t a t e s t h a t t h e p r o d u c t o f a v i r t u a l f o r c e a n d a v i r t u a l v e l o c i t y o f c o n t r a c t i o n i s c o n s t a n t w i t h i n t h e r a n g e o f o b s e r v a b l e f o r c e s a n d v e l o c i t i e s a n d t h u s , t h a t : * * F v = k * * w h e r e k i s t h e f o r c e - v e l o c i t y c o n s t a n t a n d F a n d v t h e v i r t u a l f o r c e a n d v e l o c i t y , r e s p e c t i v e l y . I n t h e c a s e o f t h e a c t o m y o s i n m o t o r , t h e t o t a l f o r c e i n c r e a s e s l i n e a r l y w i t h v e l o c i t y d u e t o t h e i n c r e a s e d o v e r l a p r e s u l t i n g f r o m t h e s u p p l y o f H M M o v e r t h e e d g e s w h i l e t h e e l e m e n t a r y f o r c e Fu c o n t r i b u t e s t o t h e t o t a l f o r c e a c c o p d i n g t o e q ( 2 ) . As t h e v e l o c i t y i n c r e a s e s , t h e f l o w f r i c t i o n , a n d c o n s e q u e n t l y t h e t e n s i o n i n c r e a s e s , a n d t h e r e f o r e , t h e s i t u a t i o n i s a n a l o g o u s t o t h a t o f c o n t r a c t i n g m u s c l e , t h e o n l y d i f f e r e n c e b e i n g t h a t t h e o v e r l a p a l s o i n c r e a s e s w h e n t h e v e l o c i t y i n c r e a s e s . S i n c e H i l l ' s e q u a t i o n , r e l a t i n g t e n s i o n t o v e l o c i t y , h o l d s i r r e s - p e c t i v e o f t h e d e g r e e o f o v e r l a p i n s k e l e t a l m u s c l e , i t i s a p p r o p - r i a t e t o u s e i t a l s o f o r t h e " u n i t a r y " f o r c e i n t h e p r e s e n t t r e a t - m e n t . U s i n g ( 6 ) , t h e f o r c e c a n b e e l i m i n a t e d f r o m e q ( 5 ) s o t h a t i t t a k e s t h e f o r m : d t m m (7) x d v * - + A v = B d t w h e r e A a n d B a r e c o n s t a n t s g i v e n b y c/m a n d K k f m , r e s p e c t i v e l y . T o m a k e t h e s u b s t i t u t i o n ( 7 ) i s e s s e n t i a l l y t o s t a t e t h a t H i l l ' s e q u a t i o n i s v a l i d a t t h e u n i t a r y l e v e l d e f i n e d i n ( 2 ) . I n t h e f o l - l o w i n g , some c o n s e q u e n c e s o f t h i s p o s t u l a t e a r e e x a m i n e d . A s o l u t i o n t o e q u a t i o n ( 8 ) i.s: B - A t 0 A v = ( b - -) e - ( b - A) w h e r e b i s H i l l ' s c o n s t a n t , b , o r , B b - A t B B b A2 A A A A x = (- - -) e + (-- - h ) t - (-2- -) w h i c h i s e q u i v a l e n t t o : Kkm bm Kk Kkm bm C C C c 2 c x = (-7 - + ( - - b ) t - (- - -) ( 9 ) ( 1 1 ) w h e r e x i s t h e o b s e r v e d a n g l e o f r o t a t i o n , m e a s u r i n g d i s t a n c e , a n d b i s H i l l ' s c o n s t a n t , b . W i t h e x p e r i m e n t a l l y d e t e r m i n e d c o n s - t a n t s t h i s e q u a t i o n f i t s q u a l i t a t i v e l y t h e o b s e r v e d a n g l e o f r o - t a t i o n i n p r e p a r a t i o n s o f h i g h e n o u g h q u a l i t y t o a l l o w s u s t a i n e d r o t a t i o n a n d d e t e r m i n a t i o n o f t h e r a t i o B / A ( F i g . 2 ) . T h e d e c r e a - s e d v e l o c i t y o f r o t a t i o n o b s e r v e d a f t e r 3 0 - 5 0 m i n i n t h e f i g u r e i s m o s t l i k e l y d u e t o A T P d e p l e t i o n , a n d c o r r e s p o n d s t o t h e t i m e r e q u i r e d t o o b s e r v e a s h i f t o f t h e a b s o r p t i o n a t 2 8 4 nm o f H M M , w h i c h i s d u e t o t h e a c c u m u l a t i o n o f A D P ( C e r v e n , 1 9 8 5 , u n p u b l i s h e d o b s e r v a t i o n s ; c f . r e f . 5 ) . I n e x p e r i m e n t s w h e r e t h e r o t a t i o n slows d o w n e a r l i e r , p e r t u r b a t i o n o f t h e a c t i n c a n n o t b e e x c l u d e d t o b e a n a d d i t i o n a l f a c t o r . I n t h e p r e s e n t s t u d y , s u c h r a p i d c e s s a t i o n o f r o t a t i o n a f t e r a n i n i t i a l b u r s t w a s o b s e r v e d w h e n t h e a c t o m y o - s i n m o t o r was u s e d i m m e d i a t e l y a f t e r p r e p a r a t i o n . T h e m a x i m a l v e - l o c i t y i s g i v e n b y t h e s l o p e o f t h e c u r v e , o r : Kk V = (- - b ) = ( K k - b c ) 1 max C C 95 F i g . 2. E x p e r i m e n t a l r e s u l t s u s i n g a n " a c t o m y o s i n m o t o r " ( 9 , 11, F i g . 1 A ) . T h e a n g u l a r r n o v e - r n e n t i s p l o t t e d a g a i n s t time. T h e e x p e r i m e n t a l c o n s t a n t s were d e t e r m i n e d b y c u r v e - f i t t i n g a n d t h e c u r v e i s d e s c r i b e d b y t h e e q u a t i o n : x = 2 0 . 7 5 e - " l t + 2 . l t - 2 0 . 7 5 a n d , a s e x p e c t e d , i s p r o p o r t i o n a l t o t h e f o r c e c o n s t a n t r e p r e s e n - t i n g t h e q u a l i t y of t h e p r e p a r a t i o n a n d t h e f l o w - s u p p l y c o u p l i n g o f HMM, K , t h e f o r c e - v e l o c i t y c o n s t a n t , k , a n d i n v e r s e l y p r o p o r t i - o n a l t o t h e f r i c t i o n a l c o n s t a n t , c , o r t h e v i s c o s i t y . T h e o b s e r - v e d v e l o c i t y a t t i m e t i s g i v e n b y : = ( b c - K k ) - l C e-mt - ( b c - K k ) - 1 C C a n d t h e a c c e l e r a t i o n b y : As e x p e c t e d , t h e m a s s o f t h e r o t o r d o e s n o t a f f e c t t h e m a x i - m a l v e l o c i t y b u t , p r o v i d i n g i n e r t i a , a p p e a r s i n t h e e x p o n e n t i a l term d e l a y i n g t h e a c c e l e r a t i o n o f t h e r o t o r . A l s o t h e f r i c t i o n c o n s t a n t a n d c o n s e q u e n t l y t h e v i s c o s i t y d e c r e a s e s t h e a c c e l e r a - t i o n t e r m , b u t t h i s d e p e n d e n c e may n o t b e s t r a i g h t f o r w a r d s i n c e a m e d i u m o f h i g h e r v i s c o s i t y c o u l d p r o v i d e a h i g h e r c o u n t e r f o r c e r e l a t i v e t o w h i c h t h e o b s e r v a b l e a c c e l e r a t i o n t a k e s p l a c e . T h e p r e s e n t t r e a t m e n t d o e s n o t e l a b o r a t e o n H i l l ' s c o n s t a n t b , t h e n a t u r e of w h i c h i s p o o r l y k n o w n , b u t m a y b e r e l a t e d t o t h e c h e - m i c a l r e a c t i o n r a t e o r t h e " i n c r e a s e o f e n e r g y r a t e p e r g w e i g h t d e c r e a s e o f l o a d " ( 6 ) . T h e c h e m i c a l r e a c t i o n r a t e s i n u n i d i r e c t i o - n a l s t r e a m i n g s y s t e m s may i n v o l v e c o n s i d e r a b l e u t i l i z a t i o n o f ATP a n d may b e q u a l i t a t i v e l y d i f f e r e n t f r o m t h o s e d u r i n g c o n t r a c t i o n o f m u s c l e w h e r e t h e s y m m e t r y o f t h e s a r c o m e r e p r o v i d e s a n i d e a l f r a m e w o r k f o r f u t i l e c y c l e s o r A T P - r e g e n e r a t i n g c i r c u i t s . T h e p r e s e n t a n a l y s i s i n d i c a t e s t h a t H i l l ' s e q u a t i o n e x p r e s s e s a n i n h e r e n t p r o p e r t y i n v e c t o r i a l l y c o n t r a c t i n q a c t o m y o s i n a s s e m b - l i e s , i r r e s p e c t i v e o f m u s c l e e l a s t i c i t y o r f o r c e t r a n s m i s s i o n i n w h o l e m u s c l e a n d e v e n i r r e s p e c t i v e o f t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f a m y o s i n f i l a m e n t , a n d l e a d s t o s e v e r a l v e r i f y a b l e p r e d i c t i o n s . T h e s e p r e d i c t i o n s , f o r e x a m p l e t h o s e r e l a t i n g t o t h e i n f l u e n c e o f mass a n d v i s c o s i t y o n t h e c o o r d i n a t e a n d v e l o c i t y o f m o v e m e n t ? a r e i n t u i t i v e l y a c c e p t a b l e , a n d c o u l d b e c h e c k e d f o r e x a m p l e b y c h a n - g i n q t h e mass o f t h e r o t o r o r t h e v i s c o s i t y o f t h e m e d i u m b y a l t e - r i n g f o r e x a m p l e t h e c o n c e n t r a t i o n o f H M M o r t h e t e m p e r a t u r e . B e c a u s e o f t h e d i f f i c u l t y i n o b t a i n i n g e x a c t l y e q u i v a l e n t p r e p a - r a t i o n s of a c t o m y o s i n m o t o r s , w h i c h w o u l d r e q u i r e a c c u r a c y a t t h e n a n o m e t e r l e v e l , a n d s i n c e o n e p r e p a r a t i o n c a n o n l y b e u s e d o n c e , i t i s a t p r e s e n t i m p o s s i b l e t o p e r f o r m s u c h c o m p a r a t i v e e x p e r i - m e n t s . T h e m a i n c o n c l u s i o n o f t h e p r e s e n t t h e o r e t i c a l a n d s e m i - e m p i r i c a l r e s u l t s r e l a t e t o t h e v a l i d i t y o f H i l l ' s e q u a t i o n a n d p a r t j c u l a r l y i t s i n v e r s e f o r c e - v e l o c i t y r e l a t i o n s h i p . A s s u c h , t h e p r e s e n t r e s u l t s b a s e d o n t h e a s s u m p t i o n o f a u n i t a r y f o r c e e x e r t e d b y H M M a r e t h e f i r s t i n d i c a t i o n t h a t t h e f o r c e - v e l o c i t y r e l a t i o n s h i p m a y h o l d o u t s i d e t h e s a r c o m e r e . T h i s i n f o r m a t i o n w o u l d b e i m p o r t a n t t o u n d e r s t a n d t h e m o l e c u l a r m e c h a n i s m o f a c t o - m y o s i n c o n t r a c t i o n , w h i c h i s n o t y e t k n o w n , b u t f o r w h i c h s e v e r a l more o r l e s s e x a c t t h e o r i e s h a v e b e e n p r o p o s e d . ACKNOWLEDGEMENTS T h i s w o r k was s u p p o r t e d b y T h e J a p a n R e s e a r c h D e v e l o p m e n t C o r - p o r a t i o n ? T h e S w e d i s h B o a r d o f T e c h n i c a l D e v e l o p m e n t t h r o u g h T h e S w e d e n - J a p a n F o u n d a t i o n f o r R e s e a r c h a n d D e v e l o p m e n t ? T h e F a c u l t y o f P h a r m a c e u t i c a l S c i e n c e s , U n i v e r s i t y o f T o k y o a n d a g r a n t f r o m F o r t i a A B a n d T h e U n i v e r s i t y o f U p p s a l a . T h e a u t h o r i s g r a t e f u l t o P r o f . H. S h i m i z u f o r v a l u a b l e c r i t i c i z m a n d t o m e m b e r s o f h i s l a - b o r a t o r y f o r e x p e r i m e n t a l a d v i s e a n d f o r r e a d i n g t h e m a n u s c r i p t . T h a n k s a r e a l s o e x t e n d e d t o m e m b e r s o f t h e i n t e r n a t i o n a l m u s c l e r e s e a r c h c o m m u n i t y , w h o s e c o m m e n t s a s r e v i e w e r s h a v e l e a d t o i m p r e v e m e n t s of t h e p r e s e n t i n v e s t i g a t i o n . 97 REFERENCES 1. 2 . 3 . 4. 5. 6 . 7 . 6 . 9 . 1 0 . 11. 1 2 . B r o w n , S. S . : i n L. W i l s o n ( e d ) M e t h o d s I n C e l l B i o l o g y V o l 2 4 P t A . D i r e c t i o n a l G r o w t h o f A c t i n O f f P o l y l y s i n e - C o a t e d B e a d s . A c a d e m i c P r e s s , N e w Y o r k , L o n d o n , P a r i s , S a n D i e g o , S a n F r a n s i s c o , S a o P a u l o , S y d n e y , T o k y o , T o r o n t o 1 9 6 2 p p 2 9 1 - 3 0 0 C e r v e n , E : E v i d e n c e o f " I n t e r - F i l a m e n t C o o p e r a t i v i t y " I n t h e P o l y m e r i z a t i o n o f A c t i n . 3 : r d I n t l C o n g r C e l l B i o l A b s t r N:o 4 1 9 1 , 1 9 8 4 D r a b i k o w s k i , W . & G e r g e l y , 3 : T h e E f f e c t o f t h e T e m p e r a t u r e o f E x t r a c t i o n o n t h e T r o p o m y o s i n C o n t e n t i n A c t i n . 3 B i o l Chem 2 3 7 : 3 4 1 2 - 3 4 1 7 , 1 9 6 2 E b a s h i , S. & E b a s h i , F : A New P r o t e i n C o m p o n e n t P a r t i c i p a t i n g i n t h e S u p e r - p r e c i p i t a t i o n o f M y o s i n 8. 3 B i o c h e m 5 5 : 6 0 4 - 6 1 3 , 1 9 6 4 G a r r i g o s , M . , M o r e l , 3 . E . & d e l a T o r r e , 3 . G : R e - I n v e s t i g a - t i o n o f t h e S h a p e a n d S t a t e o f H y d r a t i o n o f t h e S k e l e t a l Myo- s i n S u b - F r a g m e n t 1 Monomer i n S o l u t i o n . B i o c h e m i s t r y 2 2 , 4 9 6 1 H i l l , A . V : T h e Heat o f S h o r t e n i n g a n d t h e D y n a m i c C o n s t a n t s o f Muscle. P r o c Roy S O C B 1 2 6 : 1 3 6 - 1 9 5 , 1 9 3 6 H u x l e y , A . F : Muscle S t r u c t u r e a n d T h e o r i e s o f C o n t r a c t i o n . P r o g B i o p h y s Mol B i o l 7 : 2 5 7 - 3 1 7 , 1 9 5 7 S h i m i z u , H : I n s t a b i l i t y T h e o r y o f B i o l o g i c a l M o t i l i t y . I . On t h e S t a t i s t i c a l M e c h a n i c a l N a t u r e o f B i o l o g i c a l M o t i l i t y . 3 P h y s S O C J a p a n 3 2 : 1 3 2 3 - 1 3 3 0 , 1 9 7 2 S h i m i z u , H: i n G . H . P o l l a c k & H. S u g i ( e d s ) C o n t r a c t i l e Mec- h a n i s m s i n M u s c l e . An A c t o m y o s i n M o t o r P l e n u m P u b l i s h i n g C o r p U l b r e c h t , M . , G r u b h o f e r , N . , 3 a i s l e , F. & W a l t e r , S : Die e r - s h o p f e n d e R e i n i g u n g v o n A k t i n - P r e p a r a t e n u n d Art d e r P h o s p h a t - h a l t i g e n p r o s t h e t i s c h e n G r u p p e n v o n G - u n d F - A c t i n . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 4 5 : 4 4 3 - 4 5 9 , 1 9 6 0 Y a n o , M., Y a m a m o t o , Y. & S h i m i z u , H : An A c t o m y o s i n M o t o r . N a t u r e 2 9 9 : 5 5 7 - 5 5 6 , 1 9 6 2 Y a n o , M., M i o h , H . & S h i m i z u , H : i n H . I s h i k a w a , S. H a t a n o & H . S a t o ( e d s ) C e l l M o t i l i t y : M e c h a n i s m a n d R e g u l a t i o n . P r o c Yamada C o n f e r e n c e X on C e l l M o t i l i t y 11: M e c h a n i s m a n d R e g u l a - t i o n . T h e S l a v i n g P r i n c i p l e i n C h e m o - M e c h a n i c a l E n e r g y C o n - v e r s i o n - M o t i o n - D e p e n d e n t A c t o m y o s i n A T P a s e A c t i v i t y D u r i n g R e c o n s t i t u t e d S t r e a m i n g . U n i v e r s i t y o f T o k y o P r e s s 1 9 6 5 , p p - 4 9 6 9 , 1 9 6 3 1 9 8 4 , p p 4 2 9 - 4 3 6 6 9 - 9 6 98