Upsala J Med Sci 91: 257-262, 1986 Image Analysis in Whole-body Autoradiography (WBA) Roland d'Argy Department of Toxicology, Uppsala University, Uppsala Biomedical Center, Box 594, S-75124 Uppsala, Sweden I N T R O D U C T I O N I m a g e p r o c e s s i n g by c o m p u t e r s h a s b e c o m e i n c r e a s i n g l y i m p o r t a n t f o r a wide v a r i e t y of f i e l d s , r a n g i n g f r o m a e r i a l a n d s p a c e p h o t o g r a p h y t o m e d i c a l diagnosis - e.g. i m a g e s a s s e m b l e d f r o m X-ray d a t a o r f r o m positron emission t o m o g r a p h y (PET). During t h e l a s t f i v e y e a r s , c o m p u t e r - a s s i s t e d i m a g e a n a l y s i s h a s a l s o b e e n u s e d f o r d i f f e r e n t k i n d s of a u t o r a d i o g r a p h i c a p p l i c a t i o n s . Most of t h e s e s t u d i e s , h o w e v e r , d e a l with v a r i o u s a s p e c t s of t h e brain. Thus, q u a n t i t a t i v e r e c e p t o r a u t o r a d i o g r a p h y h a s b e e n used in in v i t r o s t u d i e s on t h e d i s t r i b u t i o n of t r a n s m i t t o r r e c e p t o r s in t h e c e n t r a l n e r v o u s s y s t e m ( 5 - 7 , 12, 13). Also, q u a n t i t a t i v e a u t o r a d i o g r a p h i c in vivo t e c h n i q u e s , b a s e d on s t u d i e s of b r a i n f u n c t i o n s a n d using c o m p u t e r i z e d d e n s i t o m e t r y , h a v e b e e n d e s c r i b e d (3, 4, 11). WBA (9, 10) is a w e l l - e s t a b l i s h e d r a d i o t r a c e r t e c h n i q u e f o r s t u d y i n g t h e d i s t r i b u - t i o n of l a b e l l e d c o m p o u n d s in t h e e n t i r e a n i m a l . P r a c t i c a l l y a l l t i s s u e s , e v e n v e r y s m a l l o n e s , c a n b e s t u d i e d . In p r e g n a n t a n i m a l s , t h e c o n c e n t r a t i o n of r a d i o a c t i v i t y in t h e f e t a l t i s s u e s m a y b e c o m p a r e d w i t h t h a t of t h e m o t h e r . I n f o r m a t i o n a b o u t m e t a b o l i s m a n d t i s s u e binding m a y b e o b t a i n e d by d i f f e r e n t a p p l i c a t i o n s of WBA ( f o r r e v i e w , see r e f . 1). T h e e x t r a c t i o n of a l l i n f o r m a t i o n f r o m such s t u d i e s is v e r y t e d i o u s a n d t i m e - consuming. E a r l i e r , d e n s i t o m e t r i c d a t a w e r e o b t a i n e d by a m a n u a l d e n s i t o m e t e r a n d a s e m i q u a n t i t a t i v e s t a i r c a s e of r a d i o a c t i v e s t a n d a r d s , o r by d i r e c t i m p u l s e c o u n t i n g of punched t i s s u e p i e c e s (2). R e c e n t d e v e l o p m e n t of c o m p u t e r - a s s i s t e d i m a g e a n a l y s i s h a s now g r e a t l y i m p r o v e d t h e possibilities t o m e a s u r e a n d d e s c r i b e visual i n f o r m a t i o n o b t a i n e d f r o m t h e v a r i o u s WBA t e c h n i q u e s . In t h e following, s o m e e s s e n t i a l s t e p s involving c o m p u t e r - a s s i s t e d i m a g e a n a l y s i s will b e b r i e f l y discussed. F i r s t , a s h o r t d e s c r i p t i o n will b e given of t h e e n t i r e i m a g e a n a l y s i s s y s t e m , a n d t h e i m a g e pick-up p r o c e d u r e s , a n d b r i e f l y s o m e main p r o c e s s i n g commands"' u s e d in a n a l y z i n g whole-body a u t o r a d i o g r a m s . Finally, s o m e of t h e s e p r o c e d u r e s will b e e x e m p l i f i e d . 1 I1 ... 257 VIDEO CAMERA DISC MEMORY DIGITALIZATO LIGHT BOX Fig. I---]-l DIGITIZER PAD Fl . Block d i a g r a m of t h e i m a g e a n a l y s i s s y s t e m . IMAGE ANALYSIS SYSTEM T h e s t r u c t u r e of t h e i m a g e a n a l y s i s s y s t e m is shown in F i g u r e 1. T h e a u t o r a d i o - g r a p h i c f i l m is t r a n s i l l u m i n a t e d by a r e o s t a t - c o n t r o l l e d light-box. By p r o p e r c h o i c e of t h e c a m e r a l e n s a n d i t s d i s t a n c e t o t h e v i d e o c a m e r a , a l m o s t a n y s i z e of a u t o r a d i o g r a m c a n h e a n a l y s e d . A m i c r o c o m p u t e r w i t h a d i s c m e m o r y for t h e s t o r a g e of p i c t u r e s (up t o 120 p i c t u r e s c a n b e s t o r e d in t h e m e m o r y ) r e c e i v e s i n p u t d a t a f r o m t h e v i d e o c a m e r a v i a a n i m a g e d i g i t i z e r . T h e o u t p u t d a t a in t h e f o r m of p r o c e s s e d i m a g e s a r e s t o r e d in t h e i m a g e m e m o r y , w h e r e up t o f o u r p r o c e s s e d p i c t u r e s c a n b e a l t e r n a t i v e l y displayed o n t h e s c r e e n ( o u t p u t i m a g e ) . To t h e c o m p u t e r , a d i g i t i z e r p a d a l l o w s t h e o p e r a t o r to i n d i c a t e o b j e c t s or r e g i o n s of i n t e r e s t in t h e i m a g e , a n d t h e position, t h e m e a n o p t i c a l d e n s i t y , t h e s t a n d a r d d e v i a t i o n , a n d t h e a r e a s i z e a r e displayed on t h e t e r m i n a l , or could b e p r i n t e d on paper. In a d d i t i o n t o t h e d i s c m e m o r y , t h e s y s t e m i s a l s o c o m p l e m e n t e d w i t h a t a p e m e m o r y f o r s t o r a g e a n d back-up of t h e p r o g r a m s . IMAGE PICK-UP SYSTEM W e h a v e c h o s e n a v i d e o c a m e r a f o r t h e i m a g e pick-up s y s t e m , b e c a u s e i t h a s t h e a d v a n t a g e of b e i n g fast, s e n s i t i v e , a n d r a t h e r c h e a p . T h e i m a g e in t h e c a m e r a t u b e i s d i v i d e d by t h e v i d e o d i g i t i z e r i n t o a n a r r a y of 384 h o r i z o n t a l c o l u m n s a n d 2 4 1 v e r t i c a l rows, t h u s producing 92 5 4 4 e q u a l a n d d i s c r e t e s q u a r e s (pixels). T h e p i x e l i s t h e b a s i c e l e m e n t of t h e p i c t u r e a n d i t s s i z e a l s o d e f i n e s t h e o p t i c a l r e s o l u t i o n of t h e s y s t e m . E a c h p i x e l is t h e n a s s i g n e d a v a l u e b a s e d on t h e g r a y l e v e l o n t h a t m i n u t e p o r t i o n of t h e p i c t u r e which i t e n c o m p a s s e s . T h e d i g i t i z e r p r o v i d e s 256 d i f f e r e n t g r a y levels. A s e r i e s of g r a y f i l t e r s f r o m known o p t i c a l d e n s i t i e s c a l i b r a t e t h e g r a y l e v e l s to o p t i c a l d e n s i t y (OD), a n d t h e n a s e c o n d c a l i b r a t i o n m a y h e p e r f o r m e d , using s t a n d a r d s w i t h known a m o u n t s of r a d i o a c t i v i t y , t h u s c o n v e r t i n g t h e o p t i c a l d e n s i t i e s t o r e a l c o n c e n t r a t i o n values. 258 IMAGE PROCESSING P R O C E D U R E S I N WBA In o r d e r t o e x t r a c t as m u c h i n f o r m a t i o n as possible f r o m d i f f e r e n t WBA t e c h n i q u e s , a n u m b e r of i m a g e - e n h a n c e m e n t f u n c t i o n s c a n b e g e n e r a t e d . T h e s e h a v e b e e n e s p e c i a l l y a d a p t e d f o r t h e a n a l y s i s of whole-body a u t o r a d i o g r a m s . A d e t a i l e d d e s c r i p t i o n of b a s i c i m a g e - e n h a n c e m e n t p r o c e d u r e s (8) a n d pseudo-colour c o d i n g (3) h a s b e e n r e p o r t e d e a r l i e r . An a u t o r a d i o g r a D h i c i n v e s t i g a t i o n includes v a r i o u s l e v e l s of t h e body, a n d t h u s m o s t t i s s u e s a n d fluids c a n b e s c a n n e d . I t is possible t o o b s e r v e w h e t h e r t h e r a d i o a c t i v e [eve1 is p r e s e n t in s m a l l s t r u c t u r e s as t h e m u s c l e l a y e r of t h e i n t e s t i n a l t r a c t , or in t h e mucosa. In t h e e y e , t h e r a d i o a c t i v i t y c a n b e t r a c e d t o e.g. t h e c o r n e a , r e t i n a , p i g m e n t l a y e r s , or a q u e o u s humour. Small e n d o c r i n e o r g a n s will show up, s u c h as t h e p i t u i t a r y , t h y r o i d a n d d i f f e r e n t l a y e r s of t h e a d r e n a l c o r t e x . When i n v e s t i g a t i n g p r e g n a n t a n i m a l s , t h e a c t i v i t y c a n b e c o m p a r e d in b o t h t h e m a t e r n a l a n d t h e f e t a l tissues. [Jp t o now, t h e q u a n t i t a t i o n of s u c h s m a l l s t r u c t u r e s h a s b e e n v e r y h a r d a n d time-consuming. However, by s u i t a b l e i m a g e p r o c e s s i n g p r o c e d u r e s - as m a g n i f c g t i o n , h i s t o g r a m geneyation, a n d - oblect-c~assiffication - e v e n t h e q u a n t i t a t i o n of s u c h s m a l l s t r u c t u r e s c a n b e p e r f o r m e d v e r y r a p i d l y a n d w i t h high a c c u r a c y . Magnified p i c t u r e . T h e r e a r e t w o m e t h o d s of p e r f o r m i n g m a g n i f i c a t i o n w i t h t h i s s y s t e m . A z o o m l e n s on t h e v i d e o c a m e r a c a n b e used t o m a g n i f y o p t i c a l l y t h e i m a g e (Fig. 2 b,c,d), or t h e i m a g e c a n b e m a g n i f i e d in t h e c o m p u t e r (Fig. 2 h) by s o f t w a r e o p e r a t i o n . When d o u b l e m a g n i f i c a t i o n i s p e r f o r m e d , e a c h p i x e l of a c e r t a i n g r a y l e v e l i s r e p l a c e d by 2 x 2 p i x e l s of e q u a l v a l u e . G r a y - l e v e l h i s t o g r a m plot. T h e h i s t o g r a m is a g r a p h i c a l p l o t of t h e g r a y - s c a l e d i s t r i b u t i o n in t h e p i c t u r e . T h e h o r i z o n t a l a x i s r e p r e s e n t s t h e g r a y - s c a l e , s t a r t i n g w i t h 0 ( w h i t e ) a n d r a n g i n g t h r o u g h 255 (black), a n d t h e v e r t i c a l a x i s r e p r e s e n t s t h e n u m b e r of p i x e l s (Fig. 2 e,f,g). G r a y - l e v e l window m e a s u r e m e n t . The h i s t o g r a m p r o d u c e d as a b o v e c a n b e a n a l y z e d by s p e c i f y i n g , w i t h t h e d i g i t i z e r pad, a n y t w o g r a y levels, which r e p r e s e n t a window ( r e g i o n ) of i n t e r e s t . This p r o g r a m will c o m p r i s e t h e n u m b e r of p i x e l s ( t h e s e l e c t e d a r e a within t h e p i c t u r e ) f a l l i n g within t h i s g r a y - l e v e l window, a n d i t will p o i n t o u t t h e m e a n d e n s i t y , s t a n d a r d d e v i a t i o n , t h e s e l e c t e d g r a y - l e v e l s in t h e window, a n d t h e t o t a l n u m b e r of pixels ( t h e a r e a ) within t h e window. T h e s e l e c t e d p i x e l s will t h e n i m m e d i a t e l y s h o w u p on t h e i m a g e display (Fig. 2 b,c,d). This p r o c e d u r e c a n b e u s e d i n t e r a c t i v e l y by t h e o p e r a t o r . O b j e c t c l a s s i f i c a t i o n by g r a y - l e v e l windows. By i n s p e c t i o n of t h e h i s t o g r a m of a p i c t u r e , o n e m a y g u e s s w h e r e t h e t h r e s h o l d s should b e l o c a t e d f o r a c l a s s i f i c a t i o n of t h e i m a g e i n t o i t s d i f f e r e n t p a r t s . T o d o this, o n e a s s u m e s t h a t e a c h p e a k of t h e h i s t o g r a m c o r r e s p o n d s t o a c e r t a i n a n a t o m i c a l s t r u c t u r e of t h e a u t o r a d i o g r a m . C l a s s i f i c a t i o n of a n i m a g e on t h e basis of i t s g r a y - l e v e l h i s t o g r a m h a s b e e n shown t o b e e s p e c i a l l y u s e f u l 259 h I Fig. 2 a-i. A s e q u e n c e of p i c t u r e s f r o m t h e i m a g e display, i l l u s t r a t i n g s o m e main i m a g e p r o c e s s i n g p r o c e d u r e s in W R A . - In (a), t h e d i s t r i b u t i o n of a b e n z o d i a z e p i n a n t a g o n i s t ( R O 15-1788) i s shown in t h e o r i g i n a l a u t o r a d i o g r a m . Note t h e high a c t i v i t y in t h e b r a i n ( w h i t e a r e a ) . In (b-d), o p t i c a l l y m a g n i f i e d a n d d i g i t i z e d p i c t u r e s of t h e b r a i n , s e l e c t e d f r o m t h e original, a n d t h e i r c o r r e s p o n d i n g g r a y - l e v e l h i s t o g r a m s , a r e shown just b e l o w (el, ( f ) , a n d (g). By s e l e c t i o n of d i f f e r e n t g r a y - l e v e l windows in (e), (f), a n d (g) - d r o p s in t h e h i s t o g r a m -, a c l a s s i f i c a t i o n of v a r i o u s b r a i n a r e a s is displayed as a c h e s s p a t t e r n in (b), (c), a n d (d). Fig. 2 h i l l u s t r a t e s a c o m p u t e r m a g n i f i c a t i o n r o u t i n e , a n d e x c l u s i v e l y t h e s e l e c t e d g r a y l e v e l s o b t a i n e d f r o m t h e brain c l a s s i f i c a t i o n in (d). Fig. 2 i i l l u s t r a t e s s o m e c o m p u t e r r o u t i n e s , s u c h as "retouch", "text-writing", plus "arrows" t o m a r k tissues. 260 a b C d Fig. 3 a - f . e f S e q u e n c e of p i c t u r e s i l l u s t r a t i n g o r d i n a r y c o n t r a s t e n h a n c e r n e n t (a. b, c). a n d a n o t h e r c o m p u t e r r o u t i n e ( d , e, f ) t h a t b r i n g s o u t d e t a i l s a n d c o n t o u r s , w h i c h a p p e a r d i f f u s e in t h e o r i g i n a l p i c t u r e . T h e s e q u e n c e i l l u s t r a t e s t h e d i s t r i b u t i o n of C - l a b e l l e d d e p r i n y l in a r a t b r a i n . Fig. 3 c s h o w s t h e r e s u l t of c o n t r a s t e n h a n c e m e n t , w h e n t h e g r a y l e v e l s o b t a i n e d f r o m t h e n a r r o w h i s t o g r a m ( b ) of t h e o r i g i n a l a u t o r a d i o g r a m (a) a r e s p r e a d o v e r a w i d e r r a n g e . In ( f ) , t h e c o n t o u r s of t h e n u c l e u s c a u d a t u s / p u t a m e n a r e m a d e c l e a r by t h e u s e of t h e h i g h e s t g r a y - l e v e l p i x e l s (cf. b). T h e s e a r e m a r k e d in b l a c k (e) a n d s e l e c t e d f r o m t h e r e g i o n of i n t e r e s t (d). in m e a s u r i n g c o m p l i c a t e d s t r u c t u r e s as, e.g., t h e i n t e s t i n a l m u c o s a , t h e v a r i o u s p o r t i o n s of t h e b r a i n ( F i g . 2 h), a n d d i f f e r e n t p a r t s of t h e s p l e e n ( r e d a n d w h i t e pulp). T h i s p r o c e d u r e m i g h t a l s o b e u s e d t o e x c l u d e a c t i v i t y in blood v e s s e l s o r b i l e d u c t s , t h u s m e a s u r i n g t h e a c t i v i t y of t h e l i v e r p a r e n c h y m e e x c l u s i v e l y . E a c h c l a s s of g r a y l e v e l s (a c e r t a i n a n a t o m i c a l s t r u c t u r e ) c a n t h e n a l s o b e g i v e n a c e r t a i n c o l o u r . C O N C L U S I O N S A s i n g l e l o w - c o s t i m a g e a n a l y s i s s y s t e m h a s b e e n d e s c r i b e d . T h e i m a g e p r o c e s s i n g s y s t e m e x p l a i n e d in t h i s r e p o r t h a s b e e n e s p e c i a l l y a d a p t e d t o W B A . I t h a s l a r g e l y i n c r e a s e d t h e p o s s i b i l i t i e s t o m e a s u r e a n d d e s c r i b e v e r y s m a l l a n d h e t e r o g e n o u s s t r u c t u r e s . C o n t r a s t e n h a n c e m e n t r o u t i n e s h a v e a l s o b e e n i l l u s t r a t e d , t h u s g i v i n g t h e o b s e r v e r f u r t h e r i n f o r m a t i o n . 17-868573 26 1 A C K N O W L E D G E M E N T S W e a r e m u c h i n d e b t e d t o Dr. G o r a n S p e r b e r , D e p t . of P h y s i o l o g y a n d M e d i c a l P h y s i c s , U p p s a l a U n i v e r s i t y , w h o d i d t h e c o m p l e t e p r o g r a m m i n g of o u r I m a g e A n a l y s i s S y s t e m . 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. R E F E R E N C E S d ' A r g y , R. & U l l b e r g , S.: Whole b o d y a u t o r a d i o g r a p h y . S c i e n c e T o o l s 32: 23-26, 1985. B e r l i n , M. & U l l b e r g , S.: A c c u m u l a t i o n a n d r e t e n t i o n of m e r c u r y in t h e m o u s e . I- 111. A r c h E n v i r o n H e a l t h 6: 589-616, 1963. G o o c h e e , C., R a s b a n d W. & S o k o l o f f , L.: C o m p u t e r i z e d d e n s i t o m e t r y a n d c o l o r c o d i n g of / "C/ d e o x y g l u c o s e a u t o r a d i o g r a p h s . Ann N e u r o l 7: 359-370, 1980. G o o c h e e , C., R a s b a n d , W. & S o k o l o f f , L.: A p p l i c a t i o n of c o m p u t e r - a s s i s t e d i m a g e p r o c e s s i n g t o a u t o r a d i o g r a p h i c m e t h o d s f o r s t u d y i n g b r a i n f u n c t i o n s . T I N S 6: 256- 260, 1983. P a l a c i o s , J.M., N i e h o f f , D.H. & K u h a r , M.J.: R e c e p t o r a u t o r a d i o g r a p h y w i t h t r i t i u m - s e n s i t i v e f i l m : P o t e n t i a l f o r c o m p u t e r i z e d d e n s i t o m e t r y . N e u r o s c i L e t t P e n n e y , J.B., P a n , H.S., Young, A.B., F r e y , K.A. & D a u t h , G.W.: Q u a n t i t a t i v e a u t o r a d i o g r a p h y of ( 3 H) m u s c i m o l b i n d i n g in r a t b r a i n . 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