Upsala J Med Sci 88: 17-23, 1983 Increased Platelet Volume in Manifest Diabetic Rats Ulf Eriksson’, U w e Ewald’ and Torsten Tuvemo’ Departments of Medical Cell Biology‘, and Pediatrics’, University of Uppsala, Uppsala, Sweden ABSTRACT P l a t e l e t f u n c t i o n , e v a l u a t e d as in v i t r o a g g r e g a b i l i t y , h a s b e e n r e p o r t e d to b e dis- t u r b e d in d i a b e t e s , b o t h in h u m a n s a n d animals. P l a t e l e t n u m b e r a n d m e a n v o l u m e g r e a t l y i n f l u e n c e t h e s e a g g r e g a t i o n tests. T h e p r e s e n t s t u d y w a s d e s i g n e d t o e v a l u a t e t h e i i n p a c t of t w o d i f f e r e n t d e g r e e s of e x p e r i m e n t a l l y induced g l u c o s e i n t o l e r a n c e on p l a t e l e t n u m b e r a n d m e a n volume. F o r t h i s purpose, w e u s e d m a n i f e s t d i a b e t i c a n d c h e m i c a l l y d i a b e t i c r a t s . In t h e c o n t r o l group, t h e f e m a l e r a t s s h o w e d a s i g n i f i c a n t l y l o w e r n u m b e r of p l a t e l e t s c o m p a r e d to t h e males. T h e c h e m i c a l l y d i a b e t i c r a t s e x h i b i t e d a t e n d e n c y t o w a r d s i n c r e a s e d m e a n p l a t e l e t v o l u m e , w h e r e a s t h e p l a t e l e t v o l u m e of t h e m a n i f e s t d i a b e t i c f e m a l e s w a s s i g n i f i c a n t l y g r e a t e r t h a n a l l o t h e r groups. T h i s i n c r e a s e w a s f o u n d t o b e mainly d u e to a g e n e r a l s h i f t t o w a r d s l a r g e r v o l u m e s of t h e individual p l a t e l e t s of t h e m a n i f e s t d i a b e t i c f e m a l e s . I t i s s u g g e s t e d , t h a t t h e e n l a r g e m e n t of t h e m e a n p l a t e l e t v o l u m e i n d u c e d by i n c r e a s e d s e v e r i t y of t h e d i a b e t i c state m a y r e f l e c t d e c r e a s e d m e a n age of t h e c i r c u l a t i n g p l a t e l e t s . T h i s i m p l i e s s h o r t e r s u r v i v a l t i m e a n d a n i n c r e a s e d t u r n o v e r of t h e p l a t e l e t p o p u l a t i o n in d i a b e t e s mellitus. INTRODUCTION D i a b e t e s m e l l i t u s in m a n i s a s s o c i a t e d w i t h i n c r e a s e d risk f o r a t h e r o s c l e r o s i s , m i c r o v a s c u l a r c o m p l i c a t i o n s (28), a n d a r t e r i a l t h r o m b o s i s (18). C h a n g e s in t h e h a e m o - static s y s t e m w i t h a l t e r e d p l a t e l e t f u n c t i o n h a v e b e e n d e m o n s t r a t e d by d i f f e r e n t in v i t r o tests in d i a b e t i c p a t i e n t s (3) and m i g h t b e involved in t h e p a t h o g e n e s i s of t h i s d i s e a s e (19). D e t e r m i n a t i o n of s u r v i v a l a n d t u r n o v e r i s b e l i e v e d t o a c c u r a t e l y r e f l e c t t h e i n v i v o f u n c t i o n of t h e p l a t e l e t s (15). Indeed, r e d u c e d p l a t e l e t s u r v i v a l h a s b e e n n o t i c e d in d i a b e t i c p a t i e n t s (7, 22). E s t i m a t i o n of n u m b e r a n d m e a n v o l u m e should r e f l e c t t h e t u r n o v e r rate of t h e p l a t e l e t s , s i n c e s m a l l a n d l i g h t p l a t e l e t s g e n e r a l l y r e p r e s e n t a n o l d e r p o p u l a t i o n t h a n large and d e n s e p l a t e l e t s (16). D i s t u r b a n c e s , s i m i l a r t o t h o s e f o u n d in h u m a n d i a b e t e s m e l l i t u s , of t h e in v i t r o p l a t e l e t f u n c t i o n h a v e b e e n d e m o n s t r a t e d i n e x p e r i m e n t a l l y d i a b e t i c r a t s (4, 9, 13, 20). C h a n g e s 2 - 8 3 2 8 5 9 17 a n a l o g o u s t o t h e p r o p o s e d a n g i o p a t h i c a l t e r a t i o n s in h u m a n d i a b e t e s m e l l i t u s , s u c h as c h a n g e d v a s c u l a r s t r u c t u r e (25) a n d v a s c u l a r b i o c h e m i s t r y (1, 30, 31) h a v e a l s o b e e n o b s e r v e d in d i a b e t i c r a t s . F u r t h e r m o r e , a l t e r e d a r a c h i d o n i c a c i d m e t a b o l i s m in t h e v e s s e l w a l l s h a s b e e n d e c r i b e d in e x p e r i m e n t a l d i a b e t e s i n t h e r a t (9-11, 29). A g a i n s t t h i s b a c k g r o u n d , t h e airn of t h e p r e s e n t s t u d y w a s t o e v a l u a t e t h e i m p a c t of t w o d i f f e r e n t d e g r e e s of c h r o n i c g l u c o s e i n t o l e r a n c e o n p l a t e l e t f u n c t i o n by e s t i m a t i n g t h e n u m b e r a n d m e a n v o l u m e of t h e p l a t e l e t s . T h e t w o d i f f e r e n t t y p e s of e x p e r i m e n t a l d i a b e t e s , used in t h i s s t u d y , h a v e b e e n previously c h a r a c t e r i z e d . T h e m i l d e r c h e m i c a l l y d i a b e t i c (CD) t y p e w a s d e s c r i b e d by P o r t h a a n d c o l l a b o r a t o r s (23) a n d t h e m a n i f e s t d i a b e t i c (MD) t y p e h a s p r e v i o u s l y b e e n used in s t u d i e s of d i a b e t e s in p r e g n a c y (5, 6). MATERIAL A N D METHODS A n i m a l s A f i r s t g r o u p c o m p r i s i n g 19 f e m a l e S p r a g u e - D a w l e y r a t s ( A n t i c i m e x AB, S o l l e n t u n a , S w e d e n ) weighing a b o u t 250 g w e r e m a d e m a n i f e s t d i a b e t i c (MD) a t 3 m o n t h s of age by a s i n g l e i.v. i n j e c t i o n of s t r e p t o z o t o c i n ( L o t no. 1613E U-9889, kindly d o n a t e d by Dr. W.E.Dulin, T h e Upjohn Co., K a l a m a z o o , MI, USA) a t a d o s e of 45 m g / k g body weight. A t t h e t i m e of t h e e x p e r i m e n t t h e a n i m a l s h a d b e e n d i a b e t i c f o r 1 - 2 m o n t h s a n d e x h i b i t e d h y p e r g l y c e m i a a n d g l u c o s u r i a , as w e l l as a m e a n w e i g h t of 206 2 3 g. A s e c o n d g r o u p of 17 f e m a l e r a t s of t h e s a m e s t r a i n w e r e g i v e n t w o i.p. i n j e c t i o n s o f a b o u t 100 m g / k g body w e i g h t of s t r e p t o z o t o c i n o n t h e s e c o n d a n d t h i r d d a y s of l i f e (23). A f t e r a t r a n s i e n t h y p e r g l y c e m i a l a s t i n g a b o u t o n e w e e k , t h e s e a n i m a l s ( s u b s e q u e n t l y d e n o t e d as CD r a t s ) a c h i e v e d only s l i g h t l y i n c r e a s e d n o n - f a s t i n g s e r u m g l u c o s e levels. T h e C D a n i m a l s w e r e 4 m o n t h s old at t h e t i m e of t h e e x p e r i m e n t a n d w e i g h e d 232 2 4 g. A t h i r d g r o u p o f 21 f e m a l e (247 2 4 g) a n d 20 m a l e r a t s (399 L 6 g), o f t h e s a m e s t r a i n , 4 m o n t h s old, s e r v e d as c o n t r o l s ( N ) a n d w e r e n o t g i v e n a n y injections. A l l a n i m a l s w e r e a l l o w e d f r e e access to w a t e r a n d l a b o r a t o r y c h o w (EWOS AB, Soder- talje, Sweden). D e t e r m i n a t i o n of p l a t e l e t n u m b e r a n d m e a n v o l u m e Blood s a m p l e s , r e p r e s e n t i n g mixed a r t e r i a l - v e n o u s blood, w e r e t a k e n f r o m t h e c u t t i p of t h e t a i l s of non-fasting animals. 1 0 m i c r o l i t e r s of f r e e flowing blood w a s o b t a i n e d a n d d i r e c t l y d i l u t e d (UNOPETTE, C l a y A d a m s , L a b o r a t o r y I n s t r u r n e n t a t i o n , P a r s i p p a n y , N J , USA). Within 20 m i n u t e s of blood sampling, t h e p l a t e l e t n u m b e r w a s d e t e r m i n e d in a n ULTRA-FLO 100 Whole Blood P l a t e l e t C o u n t e r ( C l a y A d a m s ) by a u t o m a t i z e d p a r t i c l e i m p e d a n c e c o u n t i n g . A P a r t i a l Sizing A m p l i f i e r ( N u c l e a r D a t a I n s t r u m e n t s AB, Uppsala, S w e d e n ) s i m u l t a n e o u s l y s o r t e d t h e g e n e r a t e d i m p e d a n c e s i g n a l s a c c o r d i n g to t h e individual p u l s e a m p l i t u d e s in 100 c h a n n e l s , r e s u l t i n g in a d i s t r i b u t i o n c u r v e of t h e p l a t e l e t v o l u m e s of e a c h s a m p l e in t h e r a n g e of 3 - 27 f e m t o l i t r e s (fl., 10-15 liter). Cf. Fig. 1. A m e a n p l a t e l e t v o l u m e could t h e n b e c a l c u l a t e d f o r e a c h s a m p l e , using t h e r e l a t i v e f r e q u e n c i e s of 8 sub-classes w i t h e q u a l class w i d t h of 3 fl. Cf. Fig. 2. 18 S t a t i s t i c s A l l d a t a a r e e x p r e s s e d as m e a n s L S.E.M. P r o b a b i l i t i e s (p) of c h a n c e d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e d i f f e r e n t m e a n s w e r e c a l c u l a t e d a c c o r d i n g t o S t u d e n t ' s t w o - t a i l e d t-test (21). A p l a t e l e t s ____t erythrocytes+leucocytes 4 I I I I I I I I 3 9 15 21 27 33 39 45 51 f l 1 1 Volume F i g u r e 1 . A t y p i c a l d i s t r i b u t i o n c u r v e of c o r p u s c u l a r v o l u m e s in a blood s a m p l e f r o m a N m a l e r a t . T h e r e l a t i v e f r e q u e n c y of i m p e d a n c e p u l s e s i s s h o w n ( a r b i t r a r y s c a l e ) on t h e o r d i n a t e . RESULTS T h e d i f f e r e n t l e v e l s of s e r u m g l u c o s e a r e shown in T a b l e 1. T h e r e w a s n o s e x d i f f e r e n c e in t h e N g r o u p in t h i s r e s p e c t ( p > 0.05). O n t h e o t h e r h a n d , b o t h t h e C D ( p < 0.01) a n d MD r a t s ( p < 0.001) e x h i b i t e d i n c r e a s e d s e r u m g l u c o s e v a l u e s c o m p a r e d to t h e N f e m a l e s . In p a r t i c u l a r , t h e MD f e m a l e s w e r e m a r k e d l y a b n o r m a l w i t h g l u c o s e l e v e l s a b o u t f i v e t i m e s h i g h e r t h a n t h e N f e m a l e s . T a b l e 1. S e r u m G l u c o s e C o n c e n t r a t i o n s , N u m b e r s a n d Mean Volumes of P l a t e l e t s in t h e D i f f e r e n t E x p e r i m e n t a l Groups. N , C D a n d MD d e n o t e n o r m a l , c h e m i c a l l y d i a b e t i c a n d m a n i f e s t d i a b e t i c r a t s , r e s p e c t i v e l y . M e a n s 5 S.E.M. Significances: a = p < 0.001 v e r s u s N F e m a l e , b = p < 0.01 v e r s u s N F e m a l e . No. S e r u m Platelet P l a t e l e t of G l u c o s e N u m b e r Volume rats ( m m o l / l ) ( 1 0 ~ 1 ) (fl) N Male 20 5.7 2 0.1 948 5 24= 14.07 L 0.1 1 14.08 2 0.06 14.26 5 0.1 1 N F e m a l e 2 1 5.8 2 0.2 C D F e m a l e 17 6.7 L 0.2 MD F e m a l e 19 28.5 L 0.7a 682 2 5 4 14.44 2 0.07a 745 2 27 887 2 42 b 19 T h e n u m b e r of p l a t e l e t s in t h e d i f f e r e n t e x p e r i m e n t a l g r o u p s i s shown in T a b l e 1. In t h e N g r o u p , t h e f e m a l e s h a d a s i g n i f i c a n t l y l o w e r n u m b e r of p l a t e l e t s c o m p a r e d to t h e m a l e s ( p < 0.001). C o n s i d e r i n g t h e f e m a l e s , t h e MD r a t s s h o w e d s i g n i f i c a n t l y f e w e r p l a t e l e t s c o m p a r e d to t h e C D r a t s ( p < 0.01) b u t n o t in c o m p a r i s o n w i t h t h e N a n i m a l s ( p > 0.05). T a b l e 1 a l s o shows t h e m e a n p l a t e l e t v o l u m e s of t h e d i f f e r e n t g r o u p s of r a t s . In t h e N group, n o d i f f e r e n c e s c o u l d b e found b e t w e e n t h e s e x e s ( p > 0.05). A t e n d e n c y t o w a r d s i n c r e a s e d C D f e m a l e p l a t e l e t volume c o m p a r e d t o t h e N f e m a l e s w a s n o t e d (0.05 < p < 0.10). T h i s t r e n d w a s a l s o o b s e r v e d in t h e MD r a t s , who s h o w e d a m e a n p l a t e l e t v o l u m e g r e a t e r t h a n all o t h e r groups, in p a r t i c u l a r c o m p a r e d to t h e N f e m a l e s ( p < 0.001). I n s p e c t i o n of t h e a c c u m u l a t e d m e a n v o l u m e d i s t r i b u t i o n c u r v e s of t h e N a n d MD f e m a l e g r o u p s (Fig. 2 ) s h o w e d t h a t t h e i n c r e a s e d m e a n p l a t e l e t v o l u m e of t h e MD r a t s w a s t h e r e s u l t of a g e n e r a l s h i f t of t h e d i s t r i b u t i o n c u r v e t o w a r d s l a r g e r volumes. 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 f l Mean platelet volume F i g u r e 2. A c c u m u l a t e d m e a n v o l u m e d i s t r i b u t i o n of ( f e m a l e ) N a n d MD r a t s . T h e r e l a t i v e f r e q u e n c y of i m p e d a n c e p u l s e s a r e shown on t h e o r d i n a t e . N o t e t h e g e n e r a l s h i f t of t h e MD p o p u l a t i o n t o w a r d s l a r g e r volumes. DISCUSSION T h e d e c r e a s e d n u m b e r of p l a t e l e t s in t h e f e m a l e s c o m p a r e d to t h e m a l e s in t h e c o n t r o l g r o u p h a s n o t b e e n previously d e m o n s t r a t e d in t h e r a t . P l a t e l e t n u m b e r a n d v o l u m e g r e a t l y i n f l u e n c e t h e r e s u l t s of i n v i t r o p l a t e l e t a g g r e g a t i o n s t u d i e s (121, t h e r e f o r e t h e 20 d e m o n s t r a t e d s e x d i f f e r e n c e m a y b e of i m p o r t a n c e f o r t h e e v a l u a t i o n of p l a t e l e t a g g r e g a b i l i t y . In h u m a n s , d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e s e x e s in p l a t e l e t n u m b e r (17, 27), a n d p l a t e l e t a g g r e g a b i l i t y (14, 24) h a v e b e e n r e p o r t e d . T h e r e s u l t s of t h e p r e s e n t s t u d y m a y i l l u s t r a t e t h e n e c e s s i t y to c o n s i d e r t h e s e x as w e l l as b o t h t h e p l a t e l e t n u m b e r a n d m e a n p l a t e l e t v o l u m e in t h e f u t u r e e v a l u a t i o n s of p l a t e l e t f u n c t i o n . T h e m a j o r f i n d i n g in t h i s s t u d y , t h e m a r k e d i n c r e a s e i n ,Ml3 p l a t e l e t v o l u m e , would i n d i c a t e a g e n e r a l l y d e c r e a s e d m e a n a g e in t h e p l a t e l e t p o p u l a t i o n of t h e m a n i f e s t d i a b e t i c r a t s (16). T h i s notion is f u r t h e r s u b s t a n t i a t e d by t h e f i n d i n g of a right-hand s i d e s h i f t in t h e d i s t r i b u t i o n c u r v e of t h e p l a t e l e t s . A d e c r e a s e d m e a n a g e would b e t h e r e s u l t of i n c r e a s e d t u r n o v e r a n d s h o r t e n e d s u r v i v a l t i m e of p l a t e l e t s (7, 16, 22). F u r t h e r m o r e , t h e n u m b e r of MD p l a t e l e t s t e n d e d to b e d e c r e a s e d , a n o b s e r v a t i o n a l s o in a g r e e m e n t w i t h a n i n c r e a s e d r a t e of p l a t e l e t t u r n o v e r . S i n c e younger a n d l a r g e r p l a t e l e t s are known to b e m o r e m e t a b o l i c a l l y a c t i v e (16), t h i s finding would b e c o n s i s t e n t w i t h b o t h t h e v i e w of a g e n e r a l h y p e r a g g r e g a b i l i t y of t h e p l a t e l e t s in d i a b e t e s ( 3 , 8), a n d i n c r e a s e d p l a t e l e t t u r n o v e r in v i v o (2, 7, 22). A s i m i l a r t e n d e n c y t o w a r d s i n c r e a s e d m e a n v o l u m e of t h e p l a t e l e t s w a s a l s o o b s e r v e d in t h e C D r a t s . C h a n g e s i n p l a t e l e t f u n c t i o n h a v e b e e n n o t i c e d in t h e v e r y e a r l y p h a s e s of h u m a n d i a b e t e s (26). T h e a c c u m u l a t e d d i s t r i b u t i o n c u r v e of p l a t e l e t v o l u m e s in t h e CD g r o u p did n o t s h o w a g e n e r a l s h i f t t o w a r d s l a r g e r v o l u m e s s i m i l a r to t h a t s e e n in t h e MD r a t s . T h e r e w a s i n s t e a d r a t h e r a l o c a l i z e d i n c r e a s e in t h e p r o p o r t i o n of l a r g e p l a t e l e t s . T h e p r e s e n t f i n d i n g s of i n c r e a s e d p l a t e l e t v o l u m e s c o r r e l a t i n g w i t h a n i n c r e a s e d s e v e r i t y of t h e d i a b e t i c state s u g g e s t , t h a t a d i s t u r b e d c a r b o h y d r a t e r n e t a b o l i s m m a y d i r e c t l y , o r i n d i r e c t l y , c a u s e a n i n c r e a s e d t u r n o v e r o f t h e c i r c u l a t i n g p l a t e l e t s . T h i s s u g g e s t i o n would s u p p o r t t h e n o t i o n o f i n c r e a s e d p l a t e l e t a g g r e g a t i o n i n d i a b e t e s m e l l i t u s , s i n c e s h o r t e r s u r v i v a l t i m e , d e c r e a s e d m e a n a g e a n d g e n e r a l e n l a r g e m e n t of t h e m e a n p l a t e l e t v o l u m e i m p l i c a t e s i n c r e a s e d p l a t e l e t a c t i v i t y , a n d t h e r e b y i n c r e a s e d a g g r e g a - bility. T h e p r e c i s e r e a s o n f o r t h e d y s f u n c t i o n of t h e p l a t e l e t s in d i a b e t e s m e l l i t u s i s at p r e s e n t n o t c o m p l e t e l y u n d e r s t o o d . A n i m a l m o d e l s w i t h d i f f e r e n t d e g r e e s of g l u c o s e i n t o l e r a n c e m a y t h e r e f o r e play a n i m p o r t a n t r o l e in f u t u r e r e s e a r c h on a l t e r e d p l a t e l e t f u n c t i o n i n d i a b e t e s mellitus. ACKNOWLEDGEMENTS T h e a u t h o r s a r e i n d e b t e d to B a r b r o W e s t e r b e r g , A s t r i d Nordin a n d E v a T o r n e l i u s f o r e x c e l l e n t t e c h n i c a l help. F i n a n c i a l a s s i s t a n c e h a s b e e n r e c e i v e d f r o m N o v o I n d u s t r i AB, Malmo, S w e d e n ( t o Dr. T. T u v e m o ) a n d T h e Swedish M e d i c a l R e s e a r c h C o u n c i l ( G r a n t no. 12X-109, a n d P o s t - D o c t o r a l F e l l o w s h i p no. K82-12P-6346-01 t o Dr. U. Eriksson). R E F E R E N C E S 1 . A r n q v i s t , H.J. & Dahlkvist, H.H.: E f f e c t of e x p e r i m e n t a l d i a b e t e s o n t h e 21 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 11 i n c o r p o r a t i o n of a m i n o a c i d s i n t o p r o t e i n in r a t a o r t a . Horm. Metab. Res. 11: 384- 388, 1979. 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